Préparation d’une suspension unicellulaire de cellules immunitaires à partir de tissu cérébral murin

Commencez par un cerveau murin avec des cellules neurales, non neuronales et immunitaires dans la matrice extracellulaire ou ECM du cerveau.

Hachez le tissu et mettez-le en suspension dans un milieu de culture.

Transférez ces fragments de tissu dans un tube et traitez-les avec des enzymes collagénase et DNase-I.

La collagénase digère l’ECM, libérant des cellules individuelles, tandis que la DNase-I dégrade l’ADN libre pour empêcher l’agglutination des cellules.

Ensuite, ajoutez de l’EDTA pour inactiver les enzymes collagénase.

Ajoutez un milieu de culture. Centrifugez et retirez le surnageant.

Ajoutez une solution à gradient de densité et le milieu de culture à la pastille cellulaire, créant ainsi une couche de gradient de faible densité.

Mélangez puis sous-couche la solution avec une solution à gradient de haute densité pour établir une différence de densité.

Centrifugeuse à basse vitesse pour séparer les cellules immunitaires à l’interface, avec des débris cellulaires plus légers en haut et des cellules neuronales et gliales plus lourdes en bas.

Retirez la couche supérieure et collectez les cellules immunitaires, puis transférez-les dans un autre tube.

Centrifugez et retirez le surnageant, puis remettez les cellules en suspension dans un milieu, formant une suspension unicellulaire pour les applications en aval.

Versez le tissu du cerveau ou de la moelle épinière avec le support dans une boîte de Pétri de 100 millimètres et utilisez une pince pour déplacer le tissu vers le bas. Émincez le tissu cérébral avec une lame de rasoir stérile et rassemblez le tissu au bas de l’assiette. Ajoutez 3 millilitres de RPMI complété par 10 % de FCS dans la boîte de Pétri, puis utilisez une pipette sérologique de 10 millilitres pour remettre le tissu en suspension dans le milieu et transférez-le dans un tube conique de 15 millilitres.

Ajoutez de la collagénase de type I et de la DNase I au tissu et incubez les tubes dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant 40 minutes. Retournez les tubes toutes les 15 minutes pour bien mélanger le tissu avec les enzymes. Après l’incubation, ajoutez de l’EDTA dans chaque tube pour une concentration finale de 0,01 molaire, et incubez les tubes pendant cinq minutes supplémentaires pour inactiver la collagénase.

Ajoutez 9 millilitres de RPMI, complété par 10 % de FCS dans chaque tube, puis centrifugez les tubes à 450 g pendant 5 minutes à 4 degrés Celsius. À l’aide d’une pipette Pasteur sous vide, aspirez le surnageant en prenant soin de ne pas toucher la pastille cellulaire.

Ajouter 3 millilitres de solution de gradient de densité isotonique à 100 % dans la pastille cellulaire. Ensuite, ajoutez un média RPMI 10 % FCS supplémentaire pour porter le volume final à 10 millilitres et remettez en suspension la pastille de cellule. Retournez et mélangez bien le tube. Ensuite, insérez une pipette sérologique avec 1 millilitre de solution mère à gradient de densité isotonique à 70 % dans le fond du tube.

Sous-couche lentement la solution, en faisant attention de ne pas faire de bulles. Retirez la pipette sérologique du tube en veillant à ne pas perturber le gradient. Centrifugez le tube à 800 g pendant 30 minutes à 4 degrés Celsius, puis aspirez le surnageant, y compris la couche de débris de myéline jusqu’à ce qu’il reste 2 à 3 millilitres dans le tube.

À l’aide d’une pipette de 1 millilitre, prélevez la couche cellulaire entre le gradient de densité de 30 % et de 70 % et transférez-la dans un nouveau tube de 15 millilitres. Ajouter un fluide RPMI 10 % FCS pour porter le volume final à 15 millilitres, puis centrifuger les cellules à 450 g pendant 5 minutes à 4 degrés Celsius.