Obtention d’une culture mixte de cellules gliales à partir d’un cerveau de souris néonatale

Commencez par un cerveau de souris nouveau-née et transférez-le dans un tube contenant une solution d’enzyme protéolytique.

Les enzymes dégradent la matrice extracellulaire du tissu et initient la dissociation cellulaire.

Lavez à plusieurs reprises le tissu digéré avec un milieu de croissance pour éliminer les enzymes.

À l’aide d’une pipette de plus grand diamètre, déplacez le tissu à plusieurs reprises dans la pipette afin de le dissocier en fragments plus petits.

Ensuite, à l’aide d’une pipette de plus petit diamètre, continuez à dissocier les fragments, créant une suspension cellulaire.

Filtrez cette suspension pour éliminer les amas cellulaires et obtenir une suspension unicellulaire contenant des neurones primaires et une population mixte de cellules gliales, y compris des microglies et des astrocytes.

Ensemencez les cellules dans un ballon de culture contenant un milieu de croissance et incubez pour favoriser leur adhérence.

Au fil du temps, l’absence de facteurs de croissance neuronale dans le milieu provoque la mort neuronale.

Remplacez le support usagé par un support frais. Les cellules gliales utilisent les nutriments et prolifèrent, générant une culture gliale mixte d’astrocytes et de microglies.

Transférez le cerveau dans un tube de 50 millilitres contenant 2 millilitres de trypsine-EDTA à 0,25 %, et incubez pendant 15 minutes dans un bain-marie à 37 degrés Celsius. Lavez le cerveau avec un milieu de croissance frais, en ajoutant et en retirant le milieu. Une fois les lavages terminés, ajoutez 2 millilitres de milieu de croissance par cerveau et homogénéisez en triturant le cerveau.

Lorsque le tissu cérébral ne rétrécit pas, passez à une pipette avec une ouverture plus petite. À la fin du titrage, lorsque la suspension est claire et qu’il n’y a pas de morceaux visibles, passez la suspension dans une crépine cellulaire de 70 microns pour créer une culture unicellulaire.

Ensuite, pipetez 8 à 9 millimètres de milieu de croissance dans des flacons T75, deux flacons par cerveau, et ajoutez 1 millilitre d’homogénat de cerveau dans chaque ballon. Cultivez les cellules jusqu’à l’isolement le 16e jour.