Etablissement d’une culture de cellules gliales de Müller obtenue à partir de rétines de souris

Prenez les rétines de souris contenant des cellules gliales de Müller, ou MG, et des neurones.

Placez-les dans une solution de dissociation avec des enzymes digestives et incubez avec un léger balancement pour assurer une distribution uniforme des enzymes.

Ces enzymes décomposent la matrice extracellulaire, détachant les cellules individuelles.

Pipetez les rétines de haut en bas plusieurs fois pour libérer les cellules.

Ajoutez un inhibiteur pour arrêter l’activité enzymatique, puis centrifugez.

Jetez le surnageant.

Remettre les cellules en suspension dans un milieu contenant un facteur de croissance spécifique aux cellules MG.

Transférez les cellules dans un puits et incuberez.

Au fil du temps, le facteur de croissance dans le milieu facilite la croissance et la multiplication des cellules MG tandis que les cellules neuronales non divisées périssent.

Retirez le support. Laver avec un tampon à sel.

Incuber avec une enzyme digestive pour détacher les cellules du puits.

Collectez les cellules dans un tube, puis centrifugez-les.

Jetez le surnageant contenant les cellules neuronales mortes.

Remettre les cellules MG en suspension dans le milieu pour une analyse plus approfondie.

Préparez le mélange de dissociation de la papaïne DNase I comme décrit dans le manuscrit. Maintenant, à l’aide d’une pipette de transfert à pointe agrandie, prélevez les rétines. Attendez que les rétines se déposent au bas de l’extrémité et libérez les rétines, sans HBSS excessif, dans le tube contenant le mélange de papaïne DNase I.

Ensuite, placez le tube sur un nutator dans l’incubateur et incubez pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius et avec 5 % de dioxyde de carbone. Ensuite, dissociez les cellules en pipetant soigneusement de haut en bas avec une pipette de 1 millilitre. Une fois les cellules dissociées, ajoutez 275 microlitres d’inhibiteur de protéase ovomucoïde du kit de dissociation de la papaïne pour neutraliser la papaïne, et mélangez doucement en pipetant de haut en bas.

Placez les tubes dans une centrifugeuse et faites-les tourner à 4 degrés Celsius pendant 8 minutes à une force centrifuge relative de 300. Ajoutez le facteur de croissance épidermique au volume calculé de milieu de croissance préchauffé à 37 degrés Celsius. Retirez soigneusement les tubes de la centrifugeuse.

Sans toucher la pastille au fond du tube, retirez le surnageant avec précaution et entièrement. Maintenant, remettez en suspension la pastille cellulaire avec 500 microlitres de milieu de croissance supplémenté en facteur de croissance épidermique. Ensuite, transférez la suspension cellulaire dans un puits de la plaque à 12 puits étiquetée. Rincez le tube avec 500 microlitres supplémentaires de milieu de croissance supplémenté en facteur de croissance épidermique et ajoutez-le dans le puits.

Secouez soigneusement la plaque du puits. Ensuite, placez la plaque dans l’incubateur à 37 degrés Celsius avec du dioxyde de carbone. Commencez par vérifier si la confluence cellulaire est de 90 % à 100 %. Ensuite, retirez le milieu et ajoutez 1 millilitre de HBSS froid pour bien laver le puits. Basculez doucement la plaque et retirez HBSS sans laisser de traces.

Plus tard, ajoutez 500 microlitres d’une solution préchauffée contenant de la trypsine pour détacher les cellules du puits. Balancez-vous doucement et incubez pendant 2 minutes dans un incubateur à 37 degrés Celsius. Après avoir déplacé la plaque de l’incubateur à l’enceinte de biosécurité, aspirez la solution contenant de la trypsine tout en l’inclinant. Dispersez-le soigneusement et lentement sur le puits plusieurs fois, jusqu’à ce que les cellules se détachent complètement.

Ensuite, transférez cette suspension cellulaire dans un tube stérile de 1,5 millilitre et placez les tubes dans la centrifugeuse. Faites tourner à 300 fois g pendant 8 minutes à 4 degrés Celsius et ramenez les tubes dans l’enceinte de biosécurité. Retirez le surnageant sans toucher la pastille. Maintenant, remettez soigneusement la pastille cellulaire en suspension en ajoutant 600 microlitres de milieu de croissance préchauffé et en pipetant de haut en bas environ 30 à 40 fois.