Modélisation Plasma surface de lithographie pour la création des réseaux cellulaires

L’objectif général de l’expérience suivante est de créer des microenvironnements cellulaires pour étudier des questions biologiques relatives aux comportements cellulaires individuels et de groupe qui se déroulent à des échelles micro et nanométriques. Pour ce faire, il faut d’abord concevoir des modèles qui guideront le placement des cellules. Ensuite, ces motifs sont ensuite traduits en surfaces de motifs par photolithographie, ce qui permet de créer des moules de blindage plasma par lithographie douce.

Enfin, ces moules de blindage sont disposés comme un trépied dans une boîte de Pétri pour permettre une exposition sélective des surfaces sous-jacentes au plasma, ce qui laissera un motif chimique sensible aux cellules sur les zones sous chaque moule. On peut obtenir des résultats qui montrent comment le comportement d’une cellule dépend de son microenvironnement et de son interaction avec les cellules voisines. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés sur les effets des microenvironnements sur le comportement cellulaire, telles que comment les interactions entre les groupes de cellules affectent-elles les phénomènes d’ordre supérieur ?

Et comment les signaux subcellulaires à l’échelle nanométrique affectent-ils des fonctions telles que la santé, la migration et la différenciation ? Tout d’abord, utilisez de la super colle pour fixer une diapositive de motif à une pile de diapositives vierges. Ensuite, créez un récipient de papier d’aluminium légèrement plus grand que la pile de diapositives et suffisamment grand pour contenir 30 grammes de polydiméthyl suboxane ou PDMS.

Placez la pile de diapositives dans le récipient, puis percez PDMS sur la pile de diapositives pour créer un moule initial. Ensuite, dégazez le PDMS en plaçant le récipient à l’intérieur d’une chambre à vide. Cassez toutes les bulles présentes dans le PDMS en retirant et en replaçant rapidement un doigt sur le tube de la soupape d’admission à plusieurs reprises pour permettre à l’air de circuler brièvement dans la chambre.

La vanne est fermée pour cinq minutes de dégazage ininterrompu. Laissez ensuite le PDMS durcir dans la hotte à flux propre à température ambiante pendant un à deux jours. Une fois durci, le PDMS est décollé du motif maître, formant un moule.

Ensuite, versez une fine couche de six grammes d’époxy en deux parties qui vient d’être mélangé pendant une minute dans le moule maître. Dégazez l’époxy immédiatement en utilisant de nombreux cycles de casse-bulles avant que l’époxy ne durcisse. Une fois que l’époxy Degas a été laissé reposer sans être dérangé pendant une heure, il sera partiellement durci.

Ajoutez plus d’époxy au moule sans dégazage pour produire une structure plus épaisse qui sera plus facile à manipuler dans les étapes ultérieures. Laissez ensuite l’époxy durcir pendant un à deux jours. Une fois le moule époxy durci, retirez l’époxy du moule maître PDMS, puis enroulez du ruban adhésif autour du moule époxy pour former un récipient.

Un moule fonctionnel peut ensuite être créé en versant du PDMS sur le moule époxy, en dégazant le PDMS et en durcissant le nouveau moule pendant un à deux jours. Une fois le moule de travail durci, décollez le moule de l’époxy et stockez les deux à l’intérieur de boîtes de Pétri dans un récipient en plastique scellé à l’intérieur de la hotte pour maintenir la propreté. Pour préparer un moule pour le motif de surface, coupez de petites sections du moule de travail avec une lame de rasoir et placez les sections dans une boîte de Pétri.

Les emplacements de ces sections de moule sont étiquetés à l’arrière de la boîte de Pétri avec un marqueur permanent en faisant un contour autour de l’endroit où se trouvent les sections de moule formant un trépied à partir des sections et attendez que le trépied assure un contact conforme entre le moule de travail et la surface de la boîte de Pétri. Regardez le fond de la parabole pour confirmer le bon placement, comme en témoigne la présence de canaux visibles à l’œil nu ou avec une petite loupe. Placez l’ensemble dans une chambre à plasma.

Initier le traitement au plasma après le traitement au plasma. Retirez le moule et la disposition des poids et placez la boîte de Pétri à l’intérieur d’une enceinte de biosécurité sous une lumière UV pendant 10 minutes pour la stérilisation. Conservez-y le plat jusqu’à ce qu’il soit ensemencé de cellules.

Diluez les cellules expérimentales de votre choix dans leur milieu de culture standard pour obtenir la confluence souhaitée. Lorsqu’il est placé sur la surface de la boîte de Pétri à motifs, versez trois millilitres de la solution cellulaire dans la boîte de Pétri. Incuber la boîte de Pétri à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone, 100 % d’humidité pendant plusieurs heures à plusieurs jours pour permettre aux cellules de s’assembler sur le motif créé par la cellule plasmatique.

La coloration est vérifiée par microscopie à contraste de phase. Lors de la culture de cellules de neuroblastome, ajoutez 10 micromolaires d’acide rétinoïque par jour jusqu’à ce que la différenciation cellulaire en un état semblable à celui d’un neurone soit observée. Remplacez le milieu de culture cellulaire standard tous les trois à quatre jours.

Un résultat typique de la mise en œuvre de la technique de lithographie plasma est la formation d’un motif de cellules qui ressemble à une structure arbitraire ou naturelle. Un exemple de cela peut être vu ici dans cette figure avec des neurones qui ont été différenciés avec de l’acide rétinoïque sur un motif de lignes. Et ici, dans cette figure où des lignes et des réseaux de neurones ont été créés, des types de cellules autres que les neurones peuvent également être utilisés, comme le montrent ces deux figures suivantes, cette figure montre les cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine, et cette figure montre C deux C 12 cellules musculaires squelettiques formant des grilles comme on le voit. Ici.

Des matériaux tels que la polylysine peuvent également être modelés pour faciliter l’attachement de certains types de cellules et pour d’autres utilisations. Suite à cette procédure, l’incorporation d’entrées supplémentaires telles que la microfluidique, le sondage cellulaire ou la manipulation génétique d’une protéine spécifique peut être effectuée afin de répondre à des questions supplémentaires, telles que : comment les combinaisons de stimuli affectent-elles l’ordre supérieur et le comportement cellulaire individuel ?