Modélisation Plasma surface de lithographie pour la création des réseaux cellulaires

L'objectif général de l'expérience suivante est de créer des microenvironnements cellulaires afin d'étudier des questions biologiques relatives aux comportements individuels et collectifs des cellules qui se produisent à des échelles microscopiques et nanométriques. Cela est réalisé en concevant d'abord des gabarits qui guideront ultimement le positionnement des cellules. Ensuite, ces conceptions sont traduites en surfaces structurées par photolithographie, ce qui permet la création de moules de protection plasma par lithographie douce.

Enfin, ces moules de protection sont disposés en forme de trépied dans une boîte de Pétri afin de permettre une exposition sélective des surfaces sous-jacentes au plasma, ce qui laissera un motif chimique sensible aux cellules dans les zones situées sous chaque moule. Les résultats obtenus peuvent montrer comment le comportement d'une cellule dépend de son microenvironnement et de son interaction avec les cellules voisines. Cette méthode peut aider à répondre à des questions essentielles sur les effets des microenvironnements sur le comportement cellulaire, telles que : comment les interactions entre groupes de cellules influencent-elles des phénomènes d'ordre supérieur ?

Et comment les signaux subcellulaires à l'échelle nanométrique influencent-ils des fonctions telles que la migration et la différenciation cellulaires ? Tout d'abord, utilisez de la colle super forte pour fixer une lame motif à un empilement de lames vierges. Ensuite, créez un récipient en aluminium légèrement plus grand que l'empilement de lames, et suffisamment vaste pour contenir 30 grammes de polydiméthylsiloxane ou PDMS.

Placer la pile de lames dans le récipient, puis verser du PDMS sur la pile de lames afin de créer un moule initial. Ensuite, débarrasser le PDMS des bulles d'air en plaçant le récipient dans une chambre sous vide. Éliminer les bulles présentes dans le PDMS en retirant et en remplaçant rapidement plusieurs fois un doigt sur le tube de la vanne d'admission, permettant ainsi brièvement à l'air de pénétrer dans la chambre.

La vanne est fermée pendant cinq minutes de dégazage ininterrompu. Laisser ensuite le PDMS durcir dans une hotte à flux laminaire propre à température ambiante pendant un à deux jours. Une fois durci, le PDMS est décollé du motif maître, formant ainsi un moule.

Ensuite, versez une fine couche de six grammes de résine époxy bi-composant, qui vient d'être mélangée pendant une minute, dans le moule maître. Dégazez immédiatement l'époxy à l'aide de plusieurs cycles de suppression des bulles avant que l'époxy ne durcisse. Après avoir laissé reposer l'époxy dégazé à l'abri de toute perturbation pendant une heure, il sera partiellement polymérisé.

Ajoutez davantage d'époxy dans le moule sans dégazer afin de produire une structure plus épaisse, plus facile à manipuler lors des étapes ultérieures. Laissez ensuite l'époxy durcir pendant un à deux jours. Une fois le moule en époxy durci, retirez l'époxy du moule maître en PDMS, puis enroulez du ruban adhésif autour du moule en époxy pour former un récipient.

Un moule de travail peut ensuite être créé en versant du PDMS sur le moule en époxy, en dégazant le PDMS et en polymérisant le nouveau moule pendant un à deux jours. Une fois le moule de travail polymérisé, détacher délicatement le moule de l'époxy et conserver les deux dans des boîtes de Pétri placées à l'intérieur d'un récipient en plastique hermétique, sous hotte à flux laminaire, afin de préserver leur propreté. Pour préparer un moule destiné à un façonnage de surface, découper de petites sections du moule de travail à l'aide d'une lame de rasoir et placer ces sections dans une boîte de Pétri.

Les emplacements de ces sections de moule sont indiqués au dos de la boîte de Pétri à l’aide d’un marqueur indélébile, en traçant un contour autour des zones où les sections de moule sont positionnées, formant un trépied à partir des sections, puis attendre que le trépied assure un contact conforme entre le moule fonctionnel et la surface de la boîte de Pétri. Examiner le fond de la boîte afin de confirmer un bon positionnement, attesté par la présence de canaux visibles à l’œil nu ou à l’aide d’une petite loupe. Placer l’ensemble dans une chambre à plasma.

Commencer le traitement par plasma après le traitement par plasma. Retirer le moule et la disposition du poids, puis placer la boîte de Pétri à l'intérieur d'une hotte de sécurité biologique sous lumière UV pendant 10 minutes pour stérilisation. Conserver la boîte à cet endroit jusqu'à ce qu'elle soit ensemencée avec des cellules.

Diluez les cellules expérimentales de votre choix dans leur milieu de culture standard afin d'obtenir la confluence souhaitée. Lorsqu'elles sont placées sur la surface de la boîte de Pétri dessinée, versez trois millilitres de la solution cellulaire dans la boîte de Pétri. Incubez la boîte de Pétri dessinée à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone, humidité à 100 % pendant plusieurs heures à plusieurs jours afin de permettre aux cellules de s'assembler selon le motif créé par la cellule au plasma.

L'observation du dessin est effectuée par microscopie à contraste de phase. Lors de la culture de cellules de neuroblastome, ajouter 10 micromolaire d'acide rétinoïque quotidiennement jusqu'à ce qu'une différenciation cellulaire vers un état semblable à celui d'un neurone soit observée. Remplacer le milieu de culture standard toutes les trois à quatre journées.

Un résultat typique de la mise en œuvre de la technique de lithographie par plasma est la formation d'un motif de cellules qui ressemble à une structure arbitraire ou naturelle. Un exemple de ceci peut être observé sur cette figure, où des neurones différenciés à l'acide rétinoïque se sont développés sur un motif de lignes. Et sur cette figure, où des lignes et des réseaux de neurones ont été créés. D'autres types cellulaires que les neurones peuvent également être utilisés, comme le montrent ces deux figures suivantes : cette figure montre des cellules endothéliales de veine ombilicale humaine, et cette figure montre des cellules musculaires squelettiques C2C12 formant des grilles, comme indiqué ici.

Des matériaux tels que la polylysine peuvent également être structurés afin de faciliter l'attachement de certains types cellulaires et à d'autres usages. Suite à cette procédure, l'incorporation d'entrées supplémentaires, telles que la microfluidique, le sondage cellulaire ou la manipulation génétique d'une protéine spécifique, peut être réalisée afin de répondre à des questions supplémentaires, telles que : comment les combinaisons de stimuli influencent-elles le comportement cellulaire individuel et d'ordre supérieur ?