Isolement et culture de neurones dopaminergiques du mésencéphale embryonnaire primaire de souris

Prenez du tissu du plancher du mésencéphale isolé de la région ventrale du mésencéphale d’embryons de souris.

Le tissu est riche en neurones dopaminergiques en développement, qui libèrent le neurotransmetteur dopamine.

Ajoutez une solution enzymatique pour décomposer la matrice tissulaire, détachant ainsi les cellules.

Ajouter une solution sérique contenant de la DNase I et dissocier mécaniquement le tissu digéré pour générer une suspension cellulaire. Les protéines sériques inhibent les enzymes, tandis que la DNase I dégrade l’ADN extracellulaire libéré lors de la lyse cellulaire, empêchant ainsi l’agglutination des cellules.

Laissez les débris de tissu se déposer et transférez les cellules en suspension dans un tube frais.

Centrifugez et retirez le surnageant, puis remettez les cellules en suspension dans un milieu neuronal dopaminergique, ou DPM.

Prenez une microplaque recouverte d’un substrat de culture cellulaire au centre des puits, créant ainsi des micro-îles.

Transférez les cellules au milieu des micro-îlots pour les cultiver à une forte densité.

Incuber, permettant aux cellules d’adhérer aux micro-îles.

Remplissez les puits de DPM et incubez, facilitant la croissance des neurones dopaminergiques.

Pour mettre en place des cultures embryonnaires primaires du mésencéphale à partir d’embryons de souris embryonnaires de souris du jour 13,5, regroupez tous les planchers du mésencéphale récoltés dans le même tube de 1,5 millilitre et lavez les échantillons trois fois, avec 500 microlitres de HBSS sans calcium ni magnésium par lavage. Après le dernier lavage, remplacer le HBSS par de la trypsine à 0,5 % pour une incubation de 30 minutes à 37 degrés Celsius.

À la fin de l’incubation, ajoutez 500 microlitres d’une solution de DNase I dans FBS fraîchement préparée au tissu partiellement digéré et utilisez une pipette en verre siliconé avec une pointe polie au feu pour triturer le tissu. Lorsque seules de minuscules particules à peine visibles peuvent être observées, laissez ces fragments de tissu se déposer au fond du tube de microcentrifugation et transférez le surnageant dans un tube conique vide en polypropylène de 15 millilitres.

Ajouter un millilitre de HBSS dans le tube contenant la DNase I dans la FBS, et mélanger plusieurs fois par pipetage. Transférez un millilitre de cette solution sur les particules tissulaires restantes et triturez à nouveau les échantillons. Ensuite, mettez en pool la suspension cellulaire digérée avec le tube de surnageant sans transférer les fragments de tissu restants. Après avoir trituré une fois de plus l’échantillon de tissu avec la DNase I restante dans la FBS dans la HBS, sédimentez les cellules collectées par centrifugation et aspirez le surnageant sans perturber la cuillette.

Lavez les cellules deux fois dans deux millilitres de milieu neuronal dopaminergique chauffé par lavage, et remettez les cellules en suspension à 3 x 10⁴ cellules par six microlitres de concentration de milieu frais et chaud dans un tube de microcentrifugation. Ensuite, retirez le milieu de chaque micro-îlot préalablement préparé et mélangez les cellules avec un pipetage doux avant d’utiliser une pipette de 10 microlitres pour ajouter six microlitres de cellules à chaque micro-îlot.

Lorsque toutes les cellules ont été ajoutées, remplissez les puits vides sur les bords de la plaque avec 150 microlitres d’eau ou de PBS, et placez la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire pendant une heure. À la fin de l’incubation, ajoutez 100 microlitres de milieu neuronal de dopamine fraîche dans chaque puits et remettez la plaque dans l’incubateur.