Mise en place d’une pince de patch à cellules entières pour l’enregistrement électrophysiologique à partir d’une rétine de souris à montage plat

Placez une rétine de souris à montage plat dans une solution physiologique à l’intérieur d’une chambre d’enregistrement.

À l’aide d’un microscope, placez une pipette d’enregistrement au-dessus de la rétine. La pipette contient une électrode et est remplie d’une solution interne.

Appliquez une pression positive pour éviter l’obstruction de la pipette, insérez-la dans la rétine, puis réduisez la pression pour éviter d’endommager les tissus.

Avancez la pipette vers les cellules amacrines en étoile, ou SACs, qui sont liées synaptiquement à d’autres neurones.

Approchez-vous d’une cellule jusqu’à ce qu’une fossette se forme sur sa membrane. Relâchez la pression, permettant à la membrane d’adhérer à la pointe.

Utilisez un courant négatif pour aspirer un patch à membrane dans la pipette.

Appliquez une succion pour rompre la membrane, en établissant une continuité entre l’électrode et le cytoplasme cellulaire, une technique appelée patch-clamp à cellules entières.

Pour enregistrer les courants synaptiques, appliquez une tension pour maintenir constant le potentiel membranaire du SAC.

Les neurotransmetteurs libérés par les neurones liés synaptiquement déclenchent le flux d’ions à travers les récepteurs synaptiques SAC, mesurés par l’électrode.

Dans cette procédure, filtrez la solution interne à travers un filtre à seringue dans le filament de remblayage personnalisé. Ensuite, insérez le filament dans une micropipette fraîchement tirée et distribuez la solution interne près de la pointe jusqu’à ce que la solution recouvre le fil de l’électrode d’argent sur plus de 5 millimètres. Ensuite, fixez la micropipette sur un porte-électrode doté d’une perche d’aspiration, à travers laquelle la pression à l’intérieur de l’électrode peut être ajustée en poussant ou en tirant sur le piston d’une seringue en plastique de 10 millilitres connectée à un tube.

Ensuite, placez la pipette sous l’objectif et abaissez-la à environ 100 micromètres au-dessus de la rétine. En mode suiveur de courant, utilisez le décalage CC pour mettre à zéro le signal de tension CC stationnaire. Mesurez la résistance de la pipette en mode pince de courant en injectant des courants d’ondes carrées d’amplitude fixe à travers la pipette pendant qu’elle est dans le bain. Neutralisez la différence en tournant le bouton d’accès R et utilisez la lecture sur celui-ci pour calculer la résistance de la pipette.

Après cela, amenez lentement l’électrode à environ 10 micromètres au-dessus de la rétine. Appliquez une pression positive sur l’électrode. Ensuite, observez le reflet se transformer en pointe de la pipette lorsqu’elle s’approche de la rétine.

Forcez rapidement mais doucement la pipette dans le GCL et réduisez immédiatement la pression positive. Déplacez la pipette vers un neurone marqué et évitez d’entrer en contact avec d’autres neurones, des vaisseaux sanguins et des pieds terminaux des cellules de Muller. Appliquez plus de pression positive si nécessaire pour éviter le colmatage de l’électrode.

Ensuite, positionnez la pointe de la pipette près du neurone marqué jusqu’à ce qu’une fossette soit visible. Ensuite, relâchez la pression positive et laissez la membrane plasmique rebondir sur la pointe de la pipette. Appliquez des courants négatifs de 20 à 120 pico ampères à la pipette pour aider à la formation d’un joint giga-ohm.

Il est important de permettre à la membrane cellulaire de rebondir après avoir relâché la pression positive, car une excellente étanchéité formée naturellement entre la membrane et l’ouverture de la pipette est importante pour préserver la morphologie cellulaire après l’enregistrement.

Si nécessaire, appliquez une légère aspiration pour tirer la membrane plasmique dans la pipette. Attendre cinq minutes après la formation du joint pour rompre la membrane cellulaire afin de permettre l’élimination de la solution interne renversée par superfusion. Une fois la membrane rompue, et en mode de pince actuelle, activez la balance du pont et ajustez-la à l’aide du bouton de l’axe R. Enregistrez les courants postsynaptiques excitateurs et inhibiteurs en mode pince de tension en maintenant la cellule à des potentiels d’inversion.