photostimulation et enregistrements de neurones dans des tranches d’hippocampe de souris

Prenez une tranche de cerveau de souris transfectée immobilisée dans une chambre d’enregistrement électrophysiologique perfusée avec de l’aCSF oxygéné.

Cette tranche contient les terminaisons axonales des neurones thalamiques exprimant des canaux ioniques sensibles à la lumière fusionnés à une protéine fluorescente.

Visualisez les axones des neurones thalamiques fluorescents et sélectionnez un neurone pyramidal.

Avancez une pipette enregistreuse contenant une électrode dans une solution intracellulaire vers le neurone sélectionné avec une légère pression positive.

La pression positive crée une fossette sur la membrane neuronale au contact.

Relâchez la pression pour former un joint à haute résistance.

Réglez le potentiel de membrane sur une valeur négative constante.

Appliquez une impulsion de pression négative pour rompre la membrane, ce qui permet d’obtenir une configuration à cellules entières.

Illuminez les terminaisons axonales, activant les canaux sensibles à la lumière et dépolarisant les membranes neuronales, déclenchant des potentiels d’action.

Des neurotransmetteurs excitateurs sont libérés, se liant aux récepteurs du neurone enregistré, provoquant un afflux de cations.

Enregistrez les courants post-synaptiques excitateurs résultants, indiquant une connexion synaptique directe entre les neurones.

Pour effectuer un enregistrement par patch clamp de cellules entières, transférez doucement une tranche de cerveau contenant le complexe hippocampique dans la chambre d’enregistrement. Perfuser en continu la chambre d’enregistrement avec 34 degrés Celsius ACSF bouillonné de carbogène à 2 à 3 millilitres par minute. Examinez brièvement l’expression de la GFP chronos dans les terminaisons axonales de la région d’intérêt avec un éclairage LED bleu à un grossissement de 4x.

Passez à un objectif d’immersion 63x et ajustez la mise au point. Vérifiez les axones exprimant Chronos GFP et choisissez un neurone pyramidal pour l’enregistrement par patch. Ensuite, remplissez une pipette avec une solution interne à base de gluconate de potassium. Montez-le dans le support de pipette sur la tête. Patchez la cellule en configuration de pince de tension.

Approchez-vous du neurone identifié et appuyez délicatement la pointe de la pipette sur le soma. La pression positive doit produire une fossette à la surface de la membrane. Ensuite, relâchez la pression pour créer un joint giga ohm. Une fois scellé, réglez la tension de maintien à moins 65 millivolts.

Brisez la membrane avec une forte impulsion de pression négative. Enregistrer en pince de courant ou de tension les réponses postsynaptiques à la stimulation de champ entier de 475 nanomètres LED de fibres afférentes exprimant le chronos. Stimulez avec des trains de 10 stimulations d’une durée de 2 millisecondes à 20 hertz.