Réponses postsynaptiques évoquées par la lumière dans les neurones de coupes rétiniennes de souris

Prenez une tranche rétinienne de souris adaptée à l’obscurité à l’intérieur d’une chambre d’enregistrement dans une pièce sombre. La rétine repose sur une base artificielle de soutien posée sur une gaine. Perfuser la tranche avec de l’aCSF.

Le réseau neuronal rétinien comprend des photorécepteurs synaptiquement liés aux cellules bipolaires qui font synapse avec les cellules ganglionnaires.

Placez une pipette d’enregistrement près de la rétine.

Au microscope, appliquez une pression positive en vous approchant d’une cellule ganglionnaire cible.

Passez en pression négative pour aspirer un patch membranaire, puis rompez-le pour établir une continuité avec le cytoplasme.

Dans l’obscurité, la membrane photoréceptrice reste dépolarisée, ce qui entraîne la libération de neurotransmetteurs.

Les neurotransmetteurs qui se lient aux récepteurs cellulaires bipolaires déclenchent la fermeture des canaux cationiques, inhibant la transmission du signal.

Appliquez une impulsion lumineuse pour hyperpolariser les photorécepteurs. La diminution de la libération de neurotransmetteurs déclenche l’ouverture des canaux cationiques dans les cellules bipolaires.

L’afflux de cations induit la libération de neurotransmetteurs qui se lient aux récepteurs des cellules ganglionnaires, générant un potentiel post-synaptique excitateur enregistré par la pipette.

Pour les enregistrements à pince patch, amorcez les tubes de perfusion avec le médium d’Ames et laissez toutes les bulles passer du tube. Après avoir fabriqué des pipettes d’enregistrement à l’aide d’un extracteur de verre, remplissez la pointe avec une solution de pipette. Ensuite, utilisez une remplisseuse de micropipette pour remplir environ un tiers de la pipette. Une fois remplie, rangez chaque pipette dans une boîte à pipette humide.

Ensuite, allumez l’équipement pour les enregistrements patch-clamp, y compris l’ordinateur, l’amplificateur, la caméra CCD et le microscope. Travaillant dans des conditions sombres, placez une préparation de coupe rétinienne sur la platine du microscope à l’aide d’une visionneuse infrarouge. Une fois qu’il est immobilisé, commencez la perfusion continue.

Réglez la température de perfusion sur 33 à 37 degrés Celsius. Visualisez la surface de la tranche à l’aide d’une caméra CCD. Concentrez-vous sur l’emplacement cible où résident les types de cellules cibles. Sélectionnez une cellule d’apparence saine pour l’enregistrement par patch-clamp. Une fois qu’une cellule saine est identifiée, placez une pipette d’enregistrement dans un porte-pipette et avancez la pipette jusqu’à la préparation de la tranche.

Lorsqu’il est proche de la préparation de la tranche, trouvez l’extrémité de la pipette à l’aide d’un microscope. Une fois que la pointe de la pipette est visible au microscope, déplacez la pointe vers le bas vers la cellule cible. Ensuite, réglez l’amplificateur et ajustez la pipette à picoampli 5 volts par nanoampère. Démarrez deux impulsions électriques continues d’environ 5 millivolts et d’environ 10 hertz et vérifiez la résistance de la pipette.

Une résistance idéale se situe entre 5 et 12 mégaohms pour la plupart des neurones rétiniens. Lorsque vous êtes prêt, utilisez un embout buccal ou une seringue pour souffler la solution interne, jusqu’à ce que la pointe de la pipette soit à la surface de la cellule cible. Lorsque la pression positive fait une petite fossette à la surface de la cellule, avancez légèrement l’extrémité et arrêtez de souffler.

Si la résistance de la pipette augmente continuellement, laissez-la et surveillez la résistance jusqu’à ce qu’elle atteigne plus de 1 gigaohm. Si la résistance n’augmente pas spontanément, appliquez doucement une pression négative jusqu’à ce qu’elle devienne un gigaseal. Une fois le gigaseal obtenu, modifiez le potentiel de maintien à moins 70 millivolts.

Ensuite, appliquez par intermittence une pression négative pour rompre la membrane à l’intérieur de la pointe de la pipette. Lorsque la configuration de la cellule entière est réalisée, la résistance de la pipette peut être comprise entre 500 mégaohms et un gigaohm, et le courant capacitif est observable. Enregistrez la relation I-V de moins 80 à 40 millivolts. Différents types de canaux voltage-dépendants seront activés en fonction du type de cellule. Enfin, enregistrez les courants ou tensions synaptiques évoqués par la lumière.