Inhibition médiée par les microARN des courants postsynaptiques excitateurs dans des tranches d’hippocampe de souris

Prenez des tranches de cerveau d’hippocampe de souris contenant des neurones CA3 infectés par un vecteur viral recombinant.

Le génome viral exprime un canal activé par la lumière marqué d’un rapporteur fluorescent et d’un microARN qui régule à la baisse l’expression des canaux calciques voltage-dépendants.

Placez une tranche dans une chambre d’enregistrement dans des conditions sombres. À l’aide d’un microscope, identifiez les neurones CA3 fluorescents.

Appliquez une électrode d’enregistrement sur un neurone CA1 qui reçoit des informations provenant de neurones CA3 infectés. Rompre la membrane pour enregistrer les courants ioniques intracellulaires.

Appliquez un inhibiteur pour bloquer les récepteurs inhibiteurs des neurotransmetteurs, en n’autorisant que les signaux excitateurs.

À l’aide d’impulsions lumineuses, stimulez les canaux activés par la lumière dans les neurones CA3 infectés, générant des potentiels d’action.

Chez les souris non infectées, le potentiel d’action active les canaux calciques voltage-dépendants, provoquant un afflux d’ions calcium qui déclenche la libération de neurotransmetteurs. Les neurotransmetteurs déclenchent des courants postsynaptiques excitateurs, ou EPSC, dans les neurones CA1.

Chez les souris infectées, la réduction médiée par les microARN des canaux calciques voltage-dépendants entraîne l’inhibition de l’EPSC.

Pour ce protocole, utilisez un animal qui, 15 jours avant ou plus, s’est fait injecter rAAV1/2 dans le cerveau, selon un protocole précédemment publié par Cetin et compagnie. Isolez le cerveau et faites des coupes cérébrales aiguës avec un vibratome et un aCSF glacé gazé.

Prélever les tranches de la région d’intérêt, et minimiser leur exposition à la lumière pour éviter l’activation de la sonde optogénétique. Laissez les tranches récupérer pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius dans le même aCSF. Utilisez une chambre spécialement conçue pour contenir des tranches de cerveau. Ensuite, remettez les tranches à température ambiante où elles resteront saines pendant six à huit heures.

Pour continuer, transférez une tranche dans la chambre d’enregistrement et super-fusionnez-la à deux millilitres par minute d’aCSF. Ensuite, vérifiez brièvement le signal du rapporteur fluorescent exprimé pour déterminer la localisation et l’intensité de l’infection. Ensuite, remplissez une électrode patch avec la solution intracellulaire.

Maintenant, sous éclairage infrarouge, obtenez une configuration de cellule entière étanche sur un neurone qui reçoit des entrées synaptiques des neurones infectés. La résistance série peut être laissée non compensée, mais elle doit être constante et faible. Par exemple, si les neurones pyramidaux CA3 ont été infectés, patchez les neurones pyramidaux dans le tractus proximal à médial de la région CA1.

Lorsque les cellules commencent à sembler rétrécies ou gonflées, lorsque le patchage devient difficile ou que les patchs sont instables, les tranches sélectionnées ne sont pas assez longues pour être enregistrées.

Ensuite, utilisez la pharmacologie pour isoler les courants synaptiques étudiés. Par exemple, si l’objectif est d’étudier la transmission synaptique excitatrice, bloquez la transmission synaptique inhibitrice en ajoutant de la biculline dans le bain.

Ensuite, évoquez des courants synaptiques tels que des courants postsynaptiques excitateurs à l’aide d’un laser bleu de 473 nanomètres couplé à une fibre optique positionnée sur le somata des neurones infectés. Ne dirigez pas le laser sur les axones du neurone.

Par exemple, évitez de mettre en lumière les garanties Schaffer. La dépolarisation directe des axones n’est pas souhaitable. Ensuite, ajustez la durée de la stimulation au minimum pour réduire la possibilité d’évoquer plus d’un potentiel d’action par impulsion lumineuse.

Ensuite, affinez l’intensité du laser pour évoquer un courant synaptique faible mais clairement détectable. Par exemple, pour la transmission synaptique excitatrice entre les neurones pyramidaux CA3 et CA1, ajustez l’intensité du laser pour évoquer des courants synaptiques de 20 à 50 picoampères.