Name: Administration sous-cutanée des antagonistes muscariniques et Triple-Immunocoloration du muscle releveur Longus Auris chez la souris (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 9 s
Description: Découvrez l'administration sous-cutanée d'antagonistes muscariniques et l'immunocoloration triple du muscle LAL chez la souris. Cette méthode permet d'étudier les changements morphologiques des jonctions neuromusculaires.

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Ce travail a été soutenu par la Muscular Dystrophy Association, le NIH (NS062320).

1. Administration sous-cutanée du récepteur de l'acétylcholine muscariniques (mAChR) antagonistes <ol><li> Préparer dans des conditions aseptiques la dose appropriée de l'antagoniste mAChR, (cf. tableau) en dissolvant le médicament dans du sérum physiologique stérile dans le tube de réaction 1.5ml. Les antagonistes suivants ont été utilisés: l'atropine, méthoctramine, 4-DAMP, AFDX-116, AFDX-384, MT 7. </li><li> Tirage 50 pl de la solution dans la seringue d'insuline et de a1cc utiliser une seringue pour chaque souris. Également préparer les seringues contenant du sérum physiologique seulement pour chaque souris du groupe contrôle. Tenez les seringues sur la glace jusqu'à ce que prêt à injecter. </li><li> Anesthetize souris avec de la kétamine-xylazine cocktails (120 mg / kg de kétamine, de 8 mg / kg de xylazine) Vérifier profondeur de l'anesthésie appropriée en observant l'absence de réponse à l'orteil de pincement. </li><li> Après une sédation adéquate, raser les poils couvrant la région rostrale de la tête à la région caudale du cou, essuyez restantes cheveux loin avec de l'éthanol à 70%. </li><li> Placez la souris sous stéréomicroscope, et d'insérer l'aiguille parallèlement au muscle LAL tout en tirant légèrement sur ​​l'aiguille de la seringue (Fig. 1A, B). Cela garantit que l'aiguille est insérée dans le tissu conjonctif recouvrant et ne pas directement endommager le muscle du labo lui-même. Insérez l'aiguille pour que la pointe couvre la partie caudale du muscle LAL. </li><li> Très lentement commencer à injecter la solution sur le muscle droit LAL tout en retirant la seringue, le temps d'injection totale devrait être d'environ 1 minute. Si elle est injectée correctement, la solution doit former un «dôme» qui est d'environ 1 cm de diamètre, dans la peau recouvrant qui restera pour au moins une heure. Une solution uniforme injecté couvrira les régions entières rostrale et caudale du muscle droit LAL. </li><li> Répétez la procédure toutes les 12 heures pour 1 à 7 jours. Pour d'autres études1, nous avons utilisé le même protocole d'injecter des facteurs de croissance toutes les 12 heures pour un maximum de 21 jours. Aucune des réponses anormales ont été observées chez des souris administré une anesthésie avec 2x par jour pour un maximum de 21 jours. </li></ol> 2. Dissection des muscles du labo <ol><li> Euthanasier les souris avec une surdose de pentobarbital de sodium (390 mg / kg). La mort est assurée en évaluant le manque de rythme cardiaque, après thoracotomie est réalisée. </li><li> Pin bas de la souris dans un plat de dissection, face dorsale avec une épingle dans chaque patte et une aiguille à travers le nez. </li><li> Faire la première incision dans la peau uniquement, en utilisant des ciseaux pour couper petit ressort le long de la LAL à gauche de la région juste en amont de l'oreille à la région autour de l'omoplate gauche. </li><li> Retirer délicatement la peau de cette région, mais évitez de couper trop près de l'oreille droite comme cela est l'un des points de fixation pour le muscle droit LAL. </li><li> Repérez la bande adipeux en position centrale tissu de lipides le long de la ligne médiane, sur la surface superficielle de la tête, où les muscles droit et gauche du labo rencontrer. Avec des ciseaux petit ressort, couper 1 cm sur la droite du tissu adipeux (vers l'oreille gauche) à partir du bord proximal du muscle gauche LAL jusqu'à atteindre l'épaule (Fig. 1C). </li><li> Une fois l'incision est faite, peler le muscle droit LAL avec petits forceps pour exposer la face ventrale du muscle. Coupez le tissu conjonctif et fascia tandis tirant doucement sur ​​le muscle droit LAL avec une pince (Fig. 1C). </li><li> Couper autour l'extrémité caudale du LAL à droite à la base de l'oreille. Continuer la coupe, le déplacement vers la fin rostrale de l'oreille droite, en gardant le droit de LAL remis (Fig. 1C).. Il est préférable d'inclure plus de tissu à ce stade que de risquer d'endommager le labo lui-même. Si le muscle commence à sécher, une pipette PBS 1X sur le muscle. </li><li> Placez disséqué droit LAL dans la culture plat 30mm Sylgard contenant du PBS 1X, face dorsale en place. Pin bas des quatre coins de muscles avec des épingles petit insecte. </li><li> En utilisant des pinces et ciseaux petits au printemps, nettoyez le tissu conjonctif des surfaces dorsale et ventrale du muscle droit LAL. Tournez musculaire plus et re-broches en vue de nettoyer la surface ventrale. 2-3 muscles peuvent être placés dans le même plat de 30mm. </li></ol> 3. Immunomarquage Triple NMJs LAL: Jour 1 <ol><li> Avant immunomarquage début, préparer tous les réactifs nécessaires. PBS 1X, 2% d'albumine sérique bovine BSA) / PBS, glycine 0,1 M à 2% de BSA / PBS, Triton X100 à 0,2% dans 2% BSA / PBS, et 4% de paraformaldéhyde (PFA) dans du PBS 1X seront nécessaires. Pré-refroidir dans le méthanol à -20 ° C au congélateur. </li><li> Laisser les muscles LAL épinglé dans la face dorsale vaisselle pendant ce processus. Jeter PBS 1X solution et ajouter assez de 4% (PFA) pour couvrir le muscle. Placer sur agitateur plat à la vitesse de 2 ou 3 pendant 20 minutes. Sauf mention contraire, le plat doit être placé sur un agitateur pour les étapes suivantes. </li><li> Jeter 4% PFA et laver le muscle avec du PBS 1X 3 fois, 10 'chacune. </li><li> Jeter dernière PBS 1X laver et ajoutez 0,1 M glycine dans 2% BSA / PBS solution pendant 30 '. </li><li> Jeter une solution de glycine 0,1 MD Ajouter du PBS 1X contenant rhodamine conjugué α-bungarotoxine à une concentration de 1:200 pendant 15 '. </li><li> Jeter α-bungarotoxine solution et laver les muscles dans du PBS 1X, 3 fois 10 'chacune. </li><li> Perméabiliser les tissus en y ajoutant de pré-refroidissement du méthanol et de placer le plat au congélateur à -20 ° C pendant exactement 5 minutes, sans secousses nécessaires. </li><li> Retirez le méthanol et laver 3 fois 10 'chacun avec du PBS 1X. Jeter dernier lavage et les tissus bloc avec 0,2% de Triton X-100 dans 2% BSA / PBS pendant 1 heure. Les étapes de lavage et de blocage sont réalisées à température ambiante. </li><li> Incuber les muscles durant la nuit, en secouant, à 4 ° C dans un cocktail d'anticorps primaire dilué dans la solution de blocage (cf. tableau). </li></ol> 4. Immunomarquage Triple NMJs LAL: Jour 2 <ol><li> Lavez les muscles dans du PBS 1X 3 fois, 10 'chacun à température ambiante. </li><li> Ajouter cocktail d'anticorps secondaires dans une solution de blocage pendant 1 heure à température ambiante (cf. tableau). Les muscles doivent être protégés de la lumière à partir de ce pas pour éviter la photo-blanchiment d'Alexa Fluor 647-fluorescence. </li><li> Lavez les muscles dans du PBS 1X 3 fois, 10 'chacune. </li><li> Nettoyez tout tissu conjonctif reste dans du PBS 1X, couper les bords latéraux des muscles du labo et monter sur des lames côté dorsal, en utilisant des lamelles de verre et de milieux de montage. Utilisez vernis à ongles transparent pour sécuriser lamelle en place. </li><li> Protéger les diapositives de la lumière et conserver à -20 ° C jusqu'au moment de l'analyse. </li></ol> 5. Imagerie confocale des NMJs LAL <ol><li> Des images haute résolution confocales sont obtenus avec un objectif Leica Apo plan d'huile 63X (1.4NA) sur un microscope Leica TCS 4D confocale. </li><li> Fluorescéine et Alexa 647 signaux ont été simultanément numérisées avec des lignes laser à 488 nm (argon, 488 nm, 20 mW) et 633 nm (HeNe, 633 nm, 10 mW), respectivement. En séquentiel, le signal de la rhodamine est ensuite scanné avec la ligne laser 561 nm (DPSS, 561, 20 mW). Sections optiques ont été recueillis à intervalles de 0,3 um, et le nombre d'images dans le plan z varie de 60-80. Le sténopé est ajusté à 1 Airy (107,97 UM). Le format d'image 1024 x 1024 (X, Y), avec un facteur de zoom de 1, à la vitesse des résultats 400Hz dans une taille d'image de 234,32 x 234,32 um um et la taille de pixel de 229,05 nm x 229,05 nm. </li><li> Logiciel Leica TCS-NT d'acquisition est alors utilisé pour reconstruire des images de la série Z dans les projections d'intensité maximale. </li><li> Multipanel images sont ajuster la luminosité et contraste à l'aide d'Adobe Photoshop. </li><li> Pour un muscle typiques du labo, on devrait être capable d'analyser environ 75 à 100 fr NMJs visage. La stabilité Synaptic est déterminé par des caractéristiques telles que l'alignement spatial de pré-, péri-et post-synaptiques éléments (par exemple, nerveuses, des cellules de Schwann et les muscles), et les mesures de la zone synaptique (ie, la taille des synapses). </li></ol> Les résultats représentatifs: Lors de la JNM mammifères adultes, un seul axone moteur développe des branches fines qui forme hautement différenciés tonnelles d'une terminaison nerveuse (fig. 2; vert) sur une fibre musculaire, précisément revêtue de grappes postsynaptique de AChR nicotinique (Fig. 2; Rouge) . Perisynaptically, le terminal des cellules de Schwann étroitement couvrent toutes les branches de terminaisons nerveuses présynaptiques (Fig. 2; Bleu). L'intégrité structurale et fonctionnelle de cette organisation tripartite est gravement perturbée par l'application quotidienne d'inhibiteurs mAChR sous-type spécifique. Dans l'exemple présenté ici (fig. 3), 4-humide, un antagoniste du mAChR avec une haute affinité pour les autoroutes M1, M3, M4 et M5 sous-types mAChR, évoque l'élimination sélective des terminaisons nerveuses du NMJs nombreuses sur toute la surface du muscle (figure 3B, C). En outre, le terminal des cellules de Schwann sont anormalement tranquilles 8 comme en témoigne l'étiquetage S100 lumineux sans l'extension du processus (Fig. 3B », 3C"). Postsynaptique, les fibres musculaires sont normales et il n'ya aucune perte de nAChR (figure 3B, 3C). <img src="/files/ftp_upload/3124/3124fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Localisation anatomique et l'organisation du muscle LAL. Lieu d'rostrale (rLAL), caudale (CLAL), et le nerf LAL (LALn) et des bandes des plateaux vertébraux correspondants sont présentés (A, en médaillon). L'emplacement et l'orientation de l'aiguille en ce qui concerne le muscle LAL est montré pour la procédure d'injection (B). Incision des points sont présentés pour la procédure de dissection (C). <img src="/files/ftp_upload/3124/3124fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Organisation tripartite de la JNM. Fort grossissement vues confocale d'un JNM souris. Un seul axone élabore fines branches terminales (A), bien couvert par la borne cellule de Schwann et de leurs procédés (A ', point astérisques à des organes terminaux des cellules de Schwann). Postsynaptique dans une fibre musculaire, une grappe de AChR nicotinique est précisément apposed aux branches du nerf termiNALS et terminale des cellules de Schwann. <img src="/files/ftp_upload/3124/3124fig3.jpg" alt="Figure 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> Figure 3. Muscles LAL traités avec 4-humide, un antagoniste du mAChR. Faible et fort grossissement vues confocale des muscles LAL traités avec le véhicule ou 4-DAMP. Contrairement aux muscles traités avec le véhicule (A-A NMJs'''), nombreuses dans les terminaux des muscles 4-DAMP traités nerveuses absence (B-B''', C-C'''). Une zone encadrée dans la figure 2B est zoomée à la figure 2C.

<ol><li>Wright, M. C., Son, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ciliary+neurotrophic+factor+is+not+required+for+terminal+sprouting+and+compensatory+reinnervation+of+neuromuscular+synapses%3A+re-evaluation+of+CNTF+null+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Ciliary neurotrophic factor is not required for terminal sprouting and compensatory reinnervation of neuromuscular synapses: re-evaluation of CNTF null mice.</a> Exp Neurol. 205, 437-448 (2007).</li>
<li>Gurney, M. E., Yamamoto, H., Kwon, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+motor+neuron+sprouting+in+vivo+by+ciliary+neurotrophic+factor+and+basic+fibroblast+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Induction of motor neuron sprouting in vivo by ciliary neurotrophic factor and basic fibroblast growth factor.</a> J Neurosci. 12, 3241-3247 (1992).</li>
<li>Caroni, P., Aigner, L., Schneider, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+neuronal+determinants+locally+regulate+extrasynaptic+and+synaptic+growth+at+the+adult+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Intrinsic neuronal determinants locally regulate extrasynaptic and synaptic growth at the adult neuromuscular junction.</a> J Cell Biol. 136, 679-692 (1997).</li>
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<li>Angaut-Petit, D., Molgo, J., Connold, A. L., Faille, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+levator+auris+longus+muscle+of+the+mouse%3A+a+convenient+preparation+for+studies+of+short-+and+long-term+presynaptic+effects+of+drugs+or+toxins%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">The levator auris longus muscle of the mouse: a convenient preparation for studies of short- and long-term presynaptic effects of drugs or toxins.</a> Neurosci Lett. 82, 83-88 (1987).</li>
<li>Lanuza, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-+and+postsynaptic+maturation+of+the+neuromuscular+junction+during+neonatal+synapse+elimination+depends+on+protein+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22C.+J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Pre- and postsynaptic maturation of the neuromuscular junction during neonatal synapse elimination depends on protein kinase.</a> C. J Neurosci Res. 67, 607-617 (2002).</li>
<li>Garcia, N., Santafe, M. M., Tomas, M., Lanuza, M. A., Tomas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-term+effects+of+beta-amyloid25-35+peptide+aggregates+on+transmitter+release+in+neuromuscular+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuropathol+Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Short-term effects of beta-amyloid25-35 peptide aggregates on transmitter release in neuromuscular synapses.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 67, 250-259 (2008).</li>
<li>Wright, M. C., Cho, W. J., Son, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+patterns+of+motor+nerve+terminal+sprouting+induced+by+ciliary+neurotrophic+factor+vs.+botulinum+toxin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Distinct patterns of motor nerve terminal sprouting induced by ciliary neurotrophic factor vs. botulinum toxin.</a> J Comp Neurol. 504, 1-16 (2007).</li>
<li>Wright, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+muscarinic+acetylcholine+receptor+subtypes+contribute+to+stability+and+growth%2C+but+not+compensatory+plasticity%2C+of+neuromuscular+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Distinct muscarinic acetylcholine receptor subtypes contribute to stability and growth, but not compensatory plasticity, of neuromuscular synapses.</a> J Neurosci. 29, 14942-14955 (2009).</li>
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<li>Murray, L. M., Gillingwater, T. H., Parson, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+mouse+cranial+muscles+to+investigate+neuromuscular+pathology+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromuscul+Disord%22%5BJournal%5D)">Using mouse cranial muscles to investigate neuromuscular pathology in vivo.</a> Neuromuscul Disord. 20, 740-743 (2009).</li>
<li>Dorje, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antagonist+binding+profiles+of+five+cloned+human+muscarinic+receptor+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Exp+Ther%22%5BJournal%5D)">Antagonist binding profiles of five cloned human muscarinic receptor subtypes.</a> J Pharmacol Exp Ther. 256, 727-733 (1991).</li>
<li>Caulfield, M. P., Birdsall, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((International+Union+of+Pharmacology.+XVII.+Classification+of+muscarinic+acetylcholine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Rev%22%5BJournal%5D)">International Union of Pharmacology. XVII. Classification of muscarinic acetylcholine receptors.</a> Pharmacol Rev. 50, 279-290 (1998).</li>
</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

La méthode présentée ici permet d&#39;établir le rôle précédemment non reconnu de sous-type de signalisation mAChR dans la stabilité et le maintien de NMJs mammifères. Cette méthode sera également utile pour tester les effets de facteurs neurotrophiques et des agents pharmacologiques. Par exemple, notre laboratoire a révélé que le facteur neurotrophique ciliaire (CNTF), a suscité la germination de presque tous les terminaisons nerveuses LAL chez la souris adulte <a>1</a> . Ce résultat contraste avec les études antérieur...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du réactif </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commentaires </th></tr><tr><td> kétamine </td><td> Hospira </td><td> NDC0409-2051-05 </td><td> Dose: 120mg/kg </td></tr><tr><td> xylazine </td><td> Laboratoires Lloyd </td><td> LA33806 </td><td> Dose: 8mg/kg </td></tr><tr><td> atropine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A0132 </td><td> (Pureté&gt; 98%); Dose: 0.2mg/kg - 20mg/kg </td></tr><tr><td> atropine </td><td> Voigt Global Distribution </td><td> AT105 </td><td> Qualité pharmaceutique </td></tr><tr><td> Méthoctramine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M105 </td><td> Dose: 100 - 400m </td></tr><tr><td> 4-DAMP </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D142 </td><td> Dose: 2,5 mg </td></tr><tr><td> AFDX-116 </td><td> Bioscience Tocris </td><td> 1105 </td><td> 250 M </td></tr><tr><td> AFDX-384 </td><td> Bioscience Tocris </td><td> 1345 </td><td> 50M - 500M </td></tr><tr><td> MT 7 </td><td> Peptides international </td><td> PMT-4340-S </td><td> 0,1 - 1M </td></tr><tr><td> Phosphate 1X saline tamponnée, pH 7,4 </td><td> Invitrogen </td><td> 10010049 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldéhyde </td><td> Fisher </td><td> T353-500 </td><td> Faire solution à 10% d&#39;abord par dissolution 10g/100mL eau désionisée distillée; faire 4% avec du PBS 1X, ajuster le pH à 7,4 </td></tr><tr><td> Sodium pentobarbital </td><td> Santé Animale Virbac </td><td> NDC-051311-050-01 </td><td> Dose: 390mg/kg </td></tr><tr><td> Sylgard </td><td> Dow Corning </td><td> Partie # 184 </td><td> Suivez les instructions qui viennent avec un kit, peut utiliser plusieurs boîte de culture de taille (30mm, 60mm, 100mm) en fonction des besoins </td></tr><tr><td> Glycine 0,1 M </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G-7126 </td><td> Ajouter 0.185g à 25ml de 2% de BSA / PBS </td></tr><tr><td> 2% d&#39;albumine de sérum bovin (BSA 2%) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A3059-100g </td><td> Dissoudre 2g BSA dans 100mL d&#39;PBS 1X </td></tr><tr><td> Triton X100 à 0,2% dans 2% BSA / PBS (tampon de blocage) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T9284-100mL </td><td> Dissoudre 0.2ml/100mL 2% BSA / PBS </td></tr><tr><td> α-bungarotoxine </td><td> Invitrogen </td><td> T1175 </td><td> Utiliser à une concentration de 1:200 </td></tr><tr><td> SMI-312 </td><td> Monoclonaux Sternberger </td><td> SMI312 </td><td> Utiliser à une concentration de 1:1000 </td></tr><tr><td> SV2 </td><td> Des études de développement de la Banque d&#39;hybridomes </td><td> SV2-Surnageant </td><td> Utiliser à une concentration de 1:10 </td></tr><tr><td> S100 </td><td> Dako </td><td> Z0311 </td><td> Utiliser à une concentration de 1:400 </td></tr><tr><td> FITC de chèvre anti-souris IgG1 </td><td> Roche </td><td> 03117731001 </td><td> Utiliser à une concentration de 1:200, mais si le fond est élevé, essayez 1:400 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 647-chèvre anti-lapin conjugué </td><td> Invitrogen </td><td> A21244 </td><td> Utiliser à une concentration de 1:200 </td></tr><tr><td> Vectashield fluorescentes montage de médias </td><td> Laboratoires Vecteur </td><td> H-1000 </td><td> Ce n&#39;est pas un média dur est défini, vous aurez besoin pour assurer la lamelle avec du vernis à ongles transparent. </td></tr><tr><td> Ciseaux petit ressort </td><td> Outils Fine Science </td><td> 15002-08 </td><td></td></tr><tr><td> Pinces à dissection </td><td> Outils Fine Science </td><td> 11295-51 </td><td></td></tr></tbody></table>

administration sous-cutanée des antagonistes muscariniques et triple-immunocoloration du muscle releveur longus auris chez la souris

Subcutaneous Administration of Muscarinic Antagonists and Triple-Immunostaining of the Levator Auris Longus Muscle in Mice

Muscles des membres postérieurs des rongeurs, comme les gastrocnémiens et du jambier antérieur, sont fréquemment utilisés pour les études pharmacologiques in vivo des signaux essentiels pour la formation et la maintenance de NMJs mammifères. Cependant, la pénétration du médicament dans ces muscles sous-cutanée ou intramusculaire est souvent incomplète ou inégale et de nombreuses NMJs peut rester inchangée. Bien que l&#39;administration systémique de dispositifs tels que des mini-pompes peuvent améliorer les effets spatio-temporelle, le caractère invasif de cette approche peut entraîner de confusion réponses inflammatoires et / ou des dommages musculaires directes. Par ailleurs, l&#39;analyse complète de la NMJs dans un muscle du membre postérieur est difficile car elle nécessite beaucoup de temps coupes sériées et immunomarquage vaste. Le labo de la souris est une fine feuille plate de muscle situé superficiellement sur le dos de la nuque. C&#39;est un tic musculaire rapide que les fonctions pour déplacer le pavillon de l&#39;oreille. Il contient des portions rostrales et caudales qui proviennent de la ligne médiane du crâne et s&#39;étendent latéralement à la partie cartilagineuse de chaque penne. Le muscle est innervé par une branche du nerf facial que les projets caudalement à sa sortie du trou stylo-mastoïdien. Nous et d&#39;autres ont trouvé du labo pour être une préparation pratique qui offre des avantages pour l&#39;enquête des deux courts et à long terme les effets in vivo de médicaments sur NMJs et les muscles. Tout d&#39;abord, sa localisation superficielle facilite multiples applications locale de médicaments sous anesthésie légère. Deuxièmement, sa minceur (2-3 couches de fibres musculaires) permet la visualisation et l&#39;analyse de presque tous les NMJs dans le muscle. Troisièmement, la facilité de le disséquer avec ses nerfs intacts avec le modèle de son innervation permet une analyse supplémentaire électrophysiologiques in vitro de 9,5. Enfin, et surtout, un petit volume appliqué (~ 50 pl) couvre facilement la surface du muscle entier, offre une exposition uniforme et prolongée de tous ses NMJs à la drogue et élimine la nécessité d&#39;une approche systémique 1,8.

Nous décrivons les procédures de l&#39;administration répétée d&#39;inhibiteurs de la signalisation muscariniques à l&#39;longus releveur Auris (LAL) de muscle de souris adultes jeunes et d&#39;immunomarquage ultérieure de ses jonctions neuromusculaires (NMJs) dans des échantillons entiers. Le muscle a des avantages uniques du labo pour révéler<em&gt; In vivo</em&gt; Effets pharmacologiques sur NMJs.

Administration sous-cutanée des antagonistes muscariniques et Triple-Immunocoloration du muscle releveur Longus Auris chez la souris

Les muscles des membres postérieurs des rongeurs, tels que le gastrocnémien et le tibial antérieur, sont fréquemment utilisés pour des études pharmacologiques in vivo sur les signaux...

L'objectif général de cette procédure est d'administrer des antagonistes muscariniques aux muscles LAL de souris adultes et d'examiner les changements morphologiques des njs en réponse à l'inhibition des récepteurs muscariniques de l'acétylcholine. Tout d'abord, les antagonistes muscariniques sont administrés par voie sous-cutanée à la fréquence et à la durée souhaitées. Après l'euthanasie, les muscles LAL traités sont soigneusement disséqués et tous les tissus conjonctifs sont retirés.Le tissu musculaire est ensuite marqué par immunolabeling triple afin de visualiser les cellules de Schwann des nerfs moteurs et les récepteurs nicotiniques de l'acétylcholine, en utilisant des méthodes d'immunohistochimie classiques. Enfin, une microscopie confocale est utilisée pour examiner les modifications morphologiques des jonctions neuromusculaires dans les muscles traités par des antagonistes muscariniques. En définitive, des résultats peuvent être obtenus qui montrent que l'organisation morphologique de la jonction neuromusculaire tripartite est gravement perturbée par l'inhibition des récepteurs muscariniques de l'acétylcholine.Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que l'administration de composés pharmaceutiques dans les muscles squelettiques des membres postérieurs de rongeur, comme le muscle gastrocnémien et le tibial antérieur, est que le muscle LAL est plus accessible et relativement mince. Cela permet une application locale répétée de médicaments et la visualisation de presque tous les njs au sein du muscle. Sur un plan de travail nettoyé à l'éthanol, dissoudre la dose appropriée d'antagoniste des récepteurs muscariniques de l'acétylcholine dans du sérum physiologique stérile dans un tube de réaction de 1,5 millilitre. Aspirer 50 microlitres de solution dans une seringue à insuline d'un cc en utilisant une seringue distincte pour chaque souris.Préparez également des seringues contenant uniquement du sérum physiologique pour chaque souris du groupe témoin, en conservant toutes les seringues sur glace jusqu’au moment de l’injection. Ensuite, anesthésiez les souris à l’aide d’un cocktail de kétamine et de xylazine. Confirmez l’anesthésie à l’aide de la technique de pincement de l’orteil ; après une sédation adéquate, rasez les poils recouvrant la région rostrale de la tête jusqu’à la région cervicale et retirez les poils résiduels avec de l’éthanol à 70 %. Placez la souris sous un microscope stéréo et insérez l’aiguille de la seringue parallèlement au muscle LAL de sorte que la pointe recouvre l’aspect caudal.Tirer doucement sur l’aiguille de la seringue afin de s’assurer qu’elle est insérée dans le tissu conjonctif superficiel et n’endommage pas directement le muscle LAL. Commencer très lentement à injecter la solution au-dessus du muscle LAL droit tout en retirant progressivement la seringue sur une durée d’environ une minute. Si l’injection est correctement réalisée, la solution doit former une bosse dans la peau superficielle qui persiste pendant au moins une heure.Répétez la procédure toutes les 12 heures pendant un à sept jours avant l'euthanasie suivie de la dissection musculaire, puis fixez la souris dans une boîte de dissection, face dorsale vers le haut. Effectuez la première incision uniquement à travers la peau à l’aide de petites ciseaux à ressort, en coupant le long du LAL gauche depuis la région située juste en proximal de l’oreille jusqu’à la région autour de l’omoplate gauche. Retirez soigneusement la peau de cette zone, mais évitez de couper trop près de l’oreille droite, car c’est l’un des points d’attache du muscle LAL droit.Localisez la bande de tissu adipeux lipidique située au centre à la surface superficielle de la tête, là où les muscles LAL droit et gauche se rejoignent, à l’aide de petites ciseaux à ressort. Coupez à un centimètre à droite du tissu adipeux et dirigez-vous vers l’oreille gauche depuis le bord proximal du muscle LAL gauche jusqu’à atteindre l’épaule. Une fois l’incision réalisée, écartez le muscle LAL droit à l’aide de petites pinces afin d’exposer sa face ventrale.Retirez le tissu conjonctif et la fascia tout en tirant délicatement vers le haut le muscle LAL droit avec une pince. Coupez autour de l'extrémité coddle du LAL droit à la base de l'oreille et progressez vers l'extrémité rostrale de l'oreille droite. Maintenez le LAL droit retourné.Il est préférable d'inclure plus de tissu à cette étape plutôt que de risquer d'endommager le LAL lui-même. Si le muscle commence à s'assécher, ajoutez une goutte de XPBS au-dessus du muscle à l'aide d'une pipette.Placer le LAL droit disséqué dans une boîte de culture de 30 millimètres contenant un XPBS, côté dorsal vers le haut. Fixer les quatre coins du muscle à l’aide de petites épingles à insectes en utilisant de petites pinces et des ciseaux à ressort. Éliminer le tissu conjonctif présent sur la surface dorsale du muscle LAL droit.Retourner le muscle et le fixer à nouveau afin de nettoyer la surface ventrale. Deux à trois muscles peuvent être placés dans le même plat de 30 millimètres pour une immunomarquage triple après une nuit. Incubation avec l'anticorps primaire.Laver les muscles dans du PBS 1x trois fois pendant 10 minutes, puis ajouter le mélange d'anticorps secondaires en solution de blocage pendant une heure. À température ambiante, maintenir les muscles en incubation à l'abri de la lumière afin d'éviter la photodégradation ; après une heure d'incubation, laver les muscles dans du PBS 1x trois fois pendant 10 minutes chacun. Après le dernier lavage, maintenir les muscles recouverts de PBS 1x frais sous un microscope stéréo, éliminer tout tissu conjonctif résiduel, puis découper les bords latéraux du LAL.Monter le tissu musculaire sur la lame, côté dorsal vers le haut. Ajouter ensuite deux ou trois gouttes de milieu de montage. Appliquer des lamelles en verre et les fixer à l’aide de vernis incolore.Protégez les lames de la lumière et conservez-les à moins 20 degrés Celsius jusqu'à ce qu'elles soient prêtes pour l'analyse ici. Des images confocales à fort grossissement d'une triple immunomarquage d'une JNM de souris montrent son organisation tripartite. Les fins rameaux terminaux, issus d'un seul axone marqué avec NFS V deux, sont étroitement recouverts par les corps cellulaires des cellules de Schwann terminales et leurs prolongements, comme le révèle la coloration par S 100 post-synaptique.Une fibre musculaire, un regroupement de récepteurs nicotiniques d'acétylcholine s'oppose précisément aux branches des terminaisons nerveuses et des cellules de Schwann terminales. Le muscle LAL d'une souris traitée au véhicule présente des JNM, dont l'organisation tripartite est intacte et possède les arborisations hautement différenciées typiques de la terminaison nerveuse, comme le montre la triple immunomarquage. En revanche, l'intégrité structurelle et fonctionnelle de cette organisation tripartite est gravement perturbée par l'application quotidienne de quatre gouttes.Un inhibiteur spécifique du sous-type de récepteur muscarinique de l'acétylcholine. Ici, quatre gouttes provoquent l'élimination sélective des terminaisons nerveuses à partir de nombreux njs répartis sur toute la surface musculaire. En outre, les cellules de Schwann terminales sont anormalement quiescentes, comme en témoigne un marquage S 100 intense sans extension de prolongements.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'administrer des antagonistes muscariniques aux muscles LAL et de réaliser une triple immunomarquage de ces muscles afin d'examiner les changements morphologiques des njs en réponse à l'inhibition de ces récepteurs.

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Administration sous-cutanée des antagonistes muscariniques et Triple-Immunocoloration du muscle releveur Longus Auris chez la souris (Vidéo) | JoVE Journal

Administration sous-cutanée des antagonistes muscariniques et Triple-Immunocoloration du muscle releveur Longus Auris chez la souris

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