in vivo Imagerie calcique à l’aide de capteurs calciques localisés synaptiquement chez Drosophila melanogaster

Fixez une mouche dont le cerveau est exposé dans une chambre d’imagerie.

La mouche exprime un indicateur calcique génétiquement codé, ou GECI, localisé dans les dendrites du corps du champignon, ou neurones MB.

Connectez la mouche avec des fils électriques et placez une aiguille de diffusion d’odeurs près de son antenne.

Ajoutez une gouttelette tampon sur le cerveau exposé, placez la mouche sous un microscope et connectez l’aiguille à un système de diffusion d’odeurs.

Excité le GECI et délivre un stimulus olfactif.

L’odorisant se lie aux récepteurs neuronaux sensoriels de l’antenne, générant des potentiels d’action.

Les potentiels d’action se propagent des neurones sensoriels aux neurones de projection, induisant la libération de neurotransmetteurs et facilitant l’afflux de calcium et la fluorescence GECI dans les neurones MB postsynaptiques.

Répétez l’opération avec un deuxième et un troisième odorant.

Ensuite, appliquez la première odeur avec un choc électrique et la seconde sans.

Enfin, délivrez les trois odeurs sans chocs. Enregistrez la fluorescence.

Une fluorescence réduite en réponse au stimulus associé au choc par rapport aux témoins révèle une plasticité synaptique induite par l’apprentissage.

Pour visualiser les indicateurs calciques basés sur la GFP, réglez le laser d’un microscope multiphotonique équipé d’un laser infrarouge et d’un objectif d’immersion dans l’eau installé sur une table isolée des vibrations, à une longueur d’onde d’excitation de 920 nanomètres, et installez un filtre passe-bande GFP. À l’aide du bouton de réglage Z grossier, balayez l’axe Z du cerveau pour localiser la région cérébrale d’intérêt.

Utilisez la fonction Recadrage pour concentrer le balayage uniquement sur la zone d’intérêt afin de minimiser le temps de balayage, et faites pivoter la vue de balayage de sorte que la partie antérieure de la tête soit tournée vers le bas. Ensuite, ajustez la taille de l’image à 512 x 512 pixels et sélectionnez la région à balayer, en tenant compte du temps de balayage calculé pour chaque image afin d’atteindre une fréquence d’images d’au moins 4 hertz.

Pour la visualisation des transitoires calciques évoqués par les odeurs, lancez un macro-package préprogrammé capable de relier le logiciel d’acquisition d’images dans le programme de diffusion des odeurs, et commencez la mesure dans le logiciel du microscope pendant 6,25 secondes pour établir une valeur de base F0.

Dans le système de diffusion des odeurs, délivrez un stimulus d’odeur de 2,5 secondes indiqué ici par l’allumage des LED déclenchées par l’ouverture et la fermeture de vannes de coupelle d’odeur spécifiques, suivi de 12,5 secondes d’enregistrement à la fin de la compensation d’odeur. Ensuite, répétez l’administration pour un deuxième et un troisième odorisant de la même manière.

Pour effectuer un conditionnement associatif dans cette configuration, utilisez le système de diffusion d’odeurs contrôlé par ordinateur pour présenter le stimulus conditionné plus l’odeur pendant 60 secondes avec des chocs électriques de 12 à 90 volts. Après une pause de 60 secondes, présentez le stimulus conditionné moins l’odeur seul pendant 60 secondes sans choc électrique. Mesurez à nouveau la transience calcique évoquée par les odeurs après l’entraînement en répétant le protocole de stimulation des odeurs avant l’entraînement, trois minutes après la fin de la phase d’entraînement