Immunomarquage par fluorescence de neurones de l’hippocampe du rat au sein d’une puce microfluidique

Prenez une puce microfluidique contenant des neurones de l’hippocampe du rat.

La puce comporte des réservoirs somatiques et axonaux, avec des compartiments divisés par des microsillons, compartimentant efficacement les neurones et isolant les régions somatiques et axonales.

Retirez le support et ajoutez du formaldéhyde. Incuber pour fixer les neurones et préserver leur structure.

Retirez l’excès de formaldéhyde et lavez avec un tampon. Ensuite, ajoutez un détergent pour perméabiliser les neurones.

Remplacez le détergent par une solution de blocage pour bloquer les sites de liaison non spécifiques.

Retirez la solution bloquante et incubez avec des anticorps primaires qui se lient à des marqueurs synaptiques neuronaux spécifiques, qui sont des protéines membranaires intégrales sur les vésicules synaptiques.

Retirez les anticorps non liés et lavez-les avec un tampon.

Incuber avec des anticorps secondaires marqués au fluorophore qui se lient aux anticorps primaires ciblant les marqueurs synaptiques.

Retirez les anticorps secondaires non liés et lavez-les avec un tampon.

Sous un microscope confocal, imagez la puce pour visualiser les marqueurs synaptiques neuronaux fluorescents.

Pour commencer l’immunocoloration par fluorescence, retirez la majeure partie du milieu de la puce, en gardant les compartiments intérieurs hydratés. Ajoutez immédiatement 100 microlitres de solution de fixation dans les puits supérieurs des compartiments axonaux et somatiques.

Au bout d’une minute, ajoutez 100 microlitres de solution de fixation dans les puits de fond et fixez les cellules pendant 30 minutes à température ambiante. Retirez la majeure partie de la solution des puits et ajoutez immédiatement 150 microlitres de PBS dans chacun des puits supérieurs des compartiments axonaux et somatiques. Attendez deux minutes que le PBS s’écoule dans les puits de fond, puis retirez le PBS et rincez les puits deux fois de plus en utilisant le même processus.

Après le dernier rinçage, retirez la majeure partie du PBS des puits de la puce et ajoutez immédiatement 150 microlitres de PBS avec 0,25 % de Triton X-100 dans chacun des puits supérieurs des compartiments axonaux et somatiques.

Attendez 15 minutes, puis retirez la majeure partie du liquide des puits. Ajoutez immédiatement 150 microlitres de solution de blocage dans chacun des puits supérieurs des compartiments axonaux et somatiques. Après 15 minutes, retirez la majeure partie du liquide des puits et ajoutez immédiatement 100 microlitres de la solution d’anticorps primaires dans chacun des puits supérieurs des compartiments axonaux et somatiques.

Couvrez la puce pour minimiser l’évaporation et incubez les cellules de l’anticorps primaire pendant une heure à température ambiante. Ensuite, rincez la puce en retirant la majeure partie de la solution et en ajoutant immédiatement 150 microlitres de PBS dans chacun des puits supérieurs des compartiments axonaux et somatiques. Après cinq minutes, retirez le PBS des deux puits et répétez le rinçage deux fois de plus.

Maintenant, retirez la majeure partie du liquide des puits et ajoutez immédiatement 100 microlitres d’anticorps secondaires dans le PBS à chacun des puits supérieurs des compartiments axonaux et somatiques. Couvrez la coque pour minimiser l’évaporation et incubez-la pendant une heure à température ambiante. Comme indiqué précédemment, rincez la puce trois fois avec du PBS. Ensuite, montez et imagez les puces comme décrit dans le protocole texte ci-joint.