Isolement des fibrilles amyloïdes à partir d’un extrait de tissu cérébral

Prenez un extrait de tissu cérébral de souris contenant des protéines non amyloïdes et des fibrilles amyloïdes, un agrégat de protéines insolubles.

Ajoutez du saccharose solide et mélangez, en augmentant la densité de la solution.

Transférez-le et centrifugez-le pour séparer les protéines plus denses des débris.

Jetez le surnageant, remettez la pastille en suspension dans un tampon à plus forte concentration de saccharose, mélangez et centrifugez.

Récupérez la couche supérieure contenant quelques fibrilles amyloïdes dans un tube frais, ajoutez un tampon de lavage et mélangez.

Maintenant, jetez la couche intermédiaire et transférez la pastille enrichie en fibrilles amyloïdes dans le tube contenant la fraction de la couche supérieure pour une isolation maximale.

Centrifuger les fractions combinées et jeter le surnageant. Ajoutez un tampon de digestion et incubez pour dégrader exclusivement les protéines non amyloïdes.

Centrifugez et retirez le surnageant. Lavez la pastille pour éliminer les protéines digérées résiduelles.

Remettez la pastille en suspension dans un tampon de solubilisation à base de saccharose contenant un détergent qui solubilise les protéines non amyloïdes restantes.

Centrifugez, retirez le surnageant et remettez en suspension les fibrilles amyloïdes isolées.

Commencez par placer une région de tissu cérébral fraîchement disséquée ou congelée dans un tube de deux millilitres contenant six à huit billes de céramique et un tampon d’homogénéisation glacé fraîchement préparé. Ensuite, broyez le tissu à l’aide d’un homogénéisateur de broyeur à billes à 4 000 tr/min, avec deux cycles de 30 secondes d’impulsion marche/arrêt. Maintenant, ajoutez neuf millilitres de tampon d’homogénéisation glacé à un millilitre d’homogénat de tissu cérébral dans un tube de 15 millilitres et scellez avec des bandes de film de cire de laboratoire.

Pour assurer une solubilisation robuste, maintenez le tube en rotation pendant la nuit à 4 degrés Celsius. Le lendemain, ajoutez du saccharose solide à la suspension d’extrait de tissu jusqu’à une concentration finale de 1,2 moles. Bien mélanger et centrifuger à 250 000 fois g pendant 45 minutes à 4 degrés Celsius. Après avoir jeté le surnageant, remettre la pastille en suspension dans deux millilitres de tampon d’homogénéisation contenant 1,9 molaire de saccharose par trituration et centrifugation à 125 000 fois g pendant 45 minutes à 4 degrés Celsius.

Après la centrifugation, transférez la couche solide blanche supérieure dans un tube frais et solubilisez dans 1 millilitre de tampon de lavage glacé en pipetant de haut en bas plusieurs fois. Étant donné que le granulé est également enrichi de fibrilles amyloïdes, jetez la couche intermédiaire aqueuse et combinez le granulé avec la couche supérieure pour un rendement plus élevé. Centrifugez les fractions combinées à 8 000 fois g pendant 20 minutes à 4 degrés Celsius.

Après avoir jeté le surnageant, remettre la pastille en suspension dans 1 millilitre de tampon de digestion glacé et incuber à température ambiante pendant trois heures sur un vortex. Centrifugez à nouveau l’échantillon, puis lavez la pastille deux fois dans 1 millilitre de tampon Tris glacé, puis centrifugez-la à nouveau. Après le deuxième lavage, remettez la pastille en suspension dans 1 millilitre de tampon de solubilisation en pipetant de haut en bas, et centrifugez rapidement le tube à 200 000 fois g pendant 60 minutes à 4 degrés Celsius.

Conservez la pastille, puis réduisez la concentration de saccharose de 1,3 à 1 molaire en ajoutant 50 millimolaires de tampon Tris au surnageant. Centrifugez à nouveau le surnageant, puis dissolvez les deux pastilles dans 100 microlitres de tampon Tris contenant 0,5 % de SDS. Pour la purification de l’amyloïde, solubiliser les pastilles riches en amyloïde à l’aide d’ondes ultrasonores dans un appareil de sonication à bain pendant 20 cycles. Ensuite, centrifugez immédiatement le matériau à 20 000 fois g pendant 30 minutes à 4 degrés Celsius.

Remettez le granulé en suspension dans 500 microlitres de tampon SDS Tris à 0,5 % et répétez le lavage quatre fois de plus. Après l’étape finale de centrifugation, lavez la pastille dans 200 microlitres d’eau ultrapure et centrifugez-la à 20 000 fois g pendant 30 minutes à 4 degrés Celsius pour éliminer tout détergent restant. Dissoudre la pastille finale contenant des fibrilles amyloïdes purifiées dans 100 microlitres d’eau ultrapure.