Name: Fermeture du tube neural dans la culture Mouse Embryo entier (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Découvrez une méthode de culture d'embryons de souris entiers pour étudier la fermeture du tube neural et l'élongation de l'axe neuro. Cette technique permet une manipulation pharmacologique directe en contournant le métabolisme maternel.

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Nous tenons à remercier le laboratoire de A. Hadjantonakis (Sloan-Kettering Institute) et le laboratoire de L. Niswander (U of Colorado-Denver) pour des conseils utiles aux techniques de dissection et la culture. Ce travail a été soutenu par NRSA NS059562 au JDG et RO1NS05897 à MER, en collaboration avec L. et J. Niswander Nadeau (Institute for Systems Biology).

1. Préparation des milieux de culture - tous les réactifs sont répertoriés dans le tableau 1 <ol><li> Sérum de rat mâle dégel à 37 ° C. </li><li> Chauffer inactiver le sérum de rat pendant 30 min à 55 ° C </li><li> Sérum de rat Centrifuger à 10K pendant 5 min à température ambiante </li><li> Retirer 50:50 surnageant et mélanger avec du phénol-rouge w gratuitement DMEM / glucose à haute </li><li> Stériliser les médias en utilisant un filtre de 0,45 um seringue </li><li> Au moins 1ml de médias / embryon devrait être préparé </li></ol> 2. Isolement de l'utérus à partir du barrage enceinte <ol><li> En utilisant les procédures approuvées par le soin des animaux et du Comité institutionnel d'utilisation (IACUC), le barrage de grossesse est d'abord anesthésiés puis sacrifiés par dislocation cervicale </li><li> Stériliser l'abdomen avec 70% EtOH </li><li> Pincez un petit chemin de la peau le long de la ligne médiane, juste au-dessus de la ligne du mamelon, avec une pince large et ouverte de l'abdomen en dessous de votre forceps avec de grands ciseaux. Soyez prudent de ne pas endommager la structure internes </li><li> Utilisez vos ciseaux pour couper latéralement de l'ouverture initiale vers les côtés de la souris pour que tout l'abdomen est ouvert </li><li> Les intestins et l'excès coussinets adipeux peuvent souvent obscurcir l'utérus et ils devraient être écartés pour que le haut de l'utérus et les ovaires peuvent être observées sur chaque côté </li><li> Pincez le haut de l'utérus ci-dessous les ovaires et l'utilisation de vos ciseaux pour séparer l'utérus de la graisse, la coupe d'une extrémité de l'utérus à l'ovaire d'autres </li><li> Soulever l'utérus avec votre pince et le placer dans une boîte de Pétri avec une solution saline </li></ol> 3. Suppression des embryons dans l'utérus <ol><li> Rincer avec une solution saline dans l'utérus pour enlever tout excès de sang et enlevez tout excès de graisse de l'extérieur </li><li> Transférer dans un plat propre avec la température ambiante. Tyrodes saline pour améliorer la visualisation </li><li> L'utilisation d'un stéréomicroscope, séparer chaque embryon en utilisant soit des petits ciseaux ou si fines nécessaires (# 5) pince pour détachez soigneusement l'utérus en dehors. </li> &lt;li&gt; Insérer une pince fine dans l'espace entre la paroi utérine et la caduque et peler la paroi utérine, en faisant attention à ne pas percer l'embryon </ol> 4. Suppression des caduque à partir d'embryons <ol><li> Orienter la caduque pour que le plus sombre partie (le placenta) est face à vous </li><li> Faire une incision avec votre pince le long de la ligne séparant la partie sombre de la caduque de l'allume-partie, en faisant attention de ne pas couper trop profondément </li><li> Remplissez la séparation du placenta par le haut du sac vitellin, en faisant attention à ne pas déchirer l'ectoplacentaire cône (EPC). A ce stade, vous devriez être capable de visualiser la membrane Reicherts sur le sac vitellin </li><li> Continuer à supprimer l'ensemble de la decidua (légers partie) en faisant attention à ne pas percer le sac vitellin </li><li> Pincer doucement et retirer le Reicherts en l'arrachement de la CBE. Si le CPE est endommagé ou séparé du sac vitellin, les embryons ne parviendra pas à tourner normalement à partir E8.5 E9.5- </li><li avec le reicherts retir l doit facilement visible travers sac vitellin et peut mis en sc par somities comptage.></ol> 5. Mise en place du système de culture <ol><li> Coupez l'extrémité d'une pipette de transfert en plastique avec des ciseaux pour augmenter le diamètre de l'ouverture de telle sorte que l'embryon peut être pipeté sans endommager le sac vitellin </li><li> Remplir les bouteilles à rouleaux propre avec 1 ml de milieu par embryon. Selon le type de bouteilles à rouleaux utilisés au maximum de 3-6 embryons peuvent être chargés dans chaque bouteille. </li><li> Transfert des embryons en utilisant votre pipette coupé à la bouteille à rouleaux supports rempli, transportant plus que Tyrodes peu que possible afin de ne pas diluer les médias </li><li> Fixez le bouchon en caoutchouc (bonde) au sommet de la bouteille en verre à rouleaux </li><li> Insérez le rouleau de bouteilles dans le tambour de la culture afin que les rouleaux un joint étanche est formé entre le bouchon et le tambour </li><li> Une fois que toutes les bouteilles ont été attachés, et tout emplacements vides dans le tambour ont été scellés avecbouchons en caoutchouc vec, activer le rouleau </li><li> Ouvrez le CO 2 et O 2 réservoirs et les ajuster à environ 2 psi, de sorte que la vanne de sortie publie une bulle par seconde. Pour E8.5-E10 embryons, 20% d'O 2 et 5% de CO 2 devraient être utilisées. </li><li> Assurez-vous que l'incubateur est fixé à 37 ° C et couvrir ou fermer l'incubateur afin que les embryons sont à l'abri de la lumière. </li><li> Les embryons doivent être vérifiés périodiquement pour évaluer leur développement par l'ajout de somities, la progression du tournage, et le degré de fermeture du tube neural </li><li> Après 2-3 heures de culture, les inhibiteurs pharmacologiques ou d'autres traitements peuvent être ajoutées aux médias </li><li> L'étude doit inclure des contrôles, tels que des véhicules ou des analogues inactifs de réactif étude. </li></ol> 6. Évaluer le développement après la culture de l'embryon entier <ol><li> Coupez le gaz, arrêt au rouleau, et enlever les bouteilles de l'incubateur </li><li> Embryons Transfert retour à Tyrodes ou de PBS dans une boîte de Petri pour l'évaluation sous stéréomicroscope </li><li> Le sac vitellin devrait apparaître comme le ballon-, un battement de cœur doit être visible et la fréquence cardiaque doit être&gt; 120 battements par minute, et la circulation devrait être évident </li><li> Photographie embryons avant l'enlèvement du sac vitellin, si nécessaire </li><li> Retirer le sac vitellin de l'embryon en perçant un trou près de la CBE, et retournant le sac vitellin et l'amnios sur la tête et la croupe de l'embryon. </li><li> Le cordon ombilical peut être coupé pour séparer le sac vitellin de l'embryon, et le sac vitellin peuvent être utilisés pour le génotypage de l'embryon, si nécessaire. </li><li> Examiner l'embryon pour le nombre des somites et des défauts du tube neural, telles que l'ouverture des plis crânienne, fermeture incomplète de la face et / ou une neuropore ouverte caudale. Les embryons peuvent être organisées selon la classification de Theiler des changements morphogénétiques multiples ( <a href="http://genex.hgu.mrc.ac.uk/Databases/Anatomy/MAstaging.html">http://www.emouseatlas.org/ EMAP / home.html</a> ) Encore une fois, un dossier photographique desdéveloppement de l'embryon est utile. </li></ol> 7. Remarques <ol><li> Une dissection de haute qualité est essentielle, car n'importe quel pseudo ou déchirures dans le sac vitellin empêchera tourner avec succès et inhibent le développement normal. L'EPC peuvent également être endommagés pendant l'enlèvement de la membrane du Reichert (RM), et si le CPE est encore partiellement séparé de la vésicule ombilicale, les embryons ne se développera pas normalement. Cependant, l'élimination incomplète de la RM peut causer des embryons de rester ensemble et / ou de cellules RM peuvent proliférer dans la culture et la constriction du sac vitellin d'expansion, tant sur ce qui empêcherait un développement normal. </li><li> Pince propre et nette sont le secret pour obtenir une dissection bien, car une pince émoussée ou pliés rendre la procédure beaucoup plus difficile. Dépôts de protéines sur des instruments conduira à une lésion tissulaire. </li><li> Propre, bouteilles en verre stériles sont également essentielles pour prévenir les embryons de coller à la paroi latérale et être endommagé. Avant de commencer l'expérience, les bouteilles doivent être scrubbed eau et au savon, rincés dans de dH 2 O, et au micro-ondes avec une petite quantité d'eau dans chaque bouteille jusqu'à ce que l'eau bout. Les bouteilles sont ensuite rincés avec 70% EtOH et sécher à l'air. </li><li> Le travail le plus rapidement possible, parce que le plus tôt l'embryon peut être transféré à la culture et des médias réchauffé à 37 ° C, le meilleur taux de survie. </li><li> Remplissez disséquer la litière en entier avant de transférer des embryons à des flacons roulants de sorte que chaque embryon est à température ambiante pour la même quantité de temps pour éviter de créer toute anomalie dans la croissance des embryons </li><li> Maintenir un environnement stérile pour éviter la contamination bactérienne des cultures. Nos expériences de culture ont été effectués sans antibiotique, mais de nombreux laboratoires ajouter des antibiotiques à leurs médias pour prévenir la croissance bactérienne. Le milieu doit apparaître comme évident à la fin de l'expérience comme il l'était au début de l'expérience. Si les médias est devenu nuageux ou il ya un précipité visible, il ya probablement un concontamination qui a infecté votre culture. </li><li> Échanges gazeux inefficace peut aussi retarder le développement des embryons, donc soyez sûr d'avoir un régulateur fiable qui assurera la prestation continue. </li><li> Embryons se développent environ 50% plus lent dans la culture ex vivo, il est donc essentiel de compter somites pour s'assurer que vous avez atteint le stade de développement approprié pour l'achèvement de l'expérience. </li></ol> 8. Les résultats représentatifs: L'apparition d'embryons pré-et post-roller culture est illustrée dans la Figure 1. Au moment de la dissection, les embryons doivent être dans une configuration hasard (fig. 1A, D) où la queue est derrière les plis tête. Après 36 heures de culture, les embryons doivent avoir terminé tourner de sorte qu'ils soient dans le C-courbes, position fœtale, où la queue est en face de la tête (figure 1B, C, E, F). La manipulation pharmacologique avec RhoA inhibiteur de kinases (Y-27632), un inhibiteur connu de l'extension convergentes au coursneurulation (Ybot-Gonzalez, 2007), aboutit à un raccourcissement des embryons au long de leur rostrale-caudale axe (Fig. 1E, F) et inhibe la fermeture crânienne neurones pli. Nos données montrent que des doses croissantes de Y-27632 altère progressivement la fermeture crânienne fois (figure 2A) et raccourcit l'axe du corps (fig. 2B), compatible avec le rôle de l'aval de RhoA de signalisation dans la neurulation crâniens et extension convergente. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3132/3132fig1.jpg"> Figure 1. Apparence des embryons et la manipulation des cultures avec l'inhibiteur pharmacologique Y-27632. (A, D) embryons disséqués à E8.5 avant toute culture de l'embryon (B, E) embryons à E10 avec le sac vitellin encore intacte, à la suite de 36hrs de la culture russes. (C, F) Le sac vitellin a été enlevée pour illustrer tourner avec succès et de fermeture du tube neural. Les embryons qui ont été traités avec l'inhibiteur de la Rho kinase Y-27632 (E, F) a échoué à subir bonne extension convergente et d'illustrerun axe du corps raccourcie. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3132/3132fig2.jpg"> Figure 2. Effet inhibiteur de la kinase de la RhoA sur la fermeture du tube neural et l'élongation du crâne axe. (A) Le pourcentage d'embryons qui ont réussi à fermer leurs plis crânienne (NTC% = pourcentage de fermeture du tube neural) est comparée à la dose de Y-27632 ajoutée aux milieux de culture. (B) La distance entre la vésicule otique et des membres antérieurs a été significativement réduite à des doses croissantes de Y-27632 (p &lt;0,05).

<ol><li>Cockroft, D. L. Dissection and culture of post implantation embryos. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCockroft%2C+DL+%22Mammalian+Postimplantation+Embryos+A+Practical+Approach%22">Mammalian Postimplantation Embryos A Practical Approach</a>. Copp, A. J., Cockroft, D. L. , IRL Press. Oxford. (1990).</li>
<li>Gray, J. D., Ross, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+insights+into+folate+supplementation+from+Crooked+tail+and+other+NTD-prone+mutant+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Res.+A.+Clin.+Mol.+Teratol%22%5BJournal%5D)">Mechanistic insights into folate supplementation from Crooked tail and other NTD-prone mutant mice.</a> Birth Defects Res. A. Clin. Mol. Teratol. 85, 314-321 (2009).</li>
<li>Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKaufman%2C+MH+%22The+Atlas+of+Mouse+Development%22">The Atlas of Mouse Development</a>. , Academic Press Limited. San Diego. (1992).</li>
<li>Ybot-Gonzalez, P., Savery, D., Gerrelli, D., Signore, M., Mitchell, C. E., Faux, C. H., Greene, N. D., Copp, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convergent+extension%2C+planar-cell-polarity+signalling+and+initiation+of+mouse+neural+tube+closure%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Convergent extension, planar-cell-polarity signalling and initiation of mouse neural tube closure.</a> Development. 134, 789-799 (2007).</li>
<li>Ross, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene-environment+interactions%2C+folate+metabolism+and+the+embryonic+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev+Syst+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Gene-environment interactions, folate metabolism and the embryonic nervous system.</a> Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 2, 471-480 (2010).</li>
</ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

La capacité de séparer la mère, les facteurs intra-utérine de ceux qui sont intrinsèques à l&#39;embryon au cours de son développement est un outil important pour étudier tous les stades de l&#39;embryogenèse. Ici, nous avons analysé les effets d&#39;un inhibiteur de la kinase à petites molécules RhoA sur utero neurulation ex crânienne, ce qui élimine la variable du métabolisme de la mère de la drogue. Cette manipulation pharmacologique n&#39;a un effet profond sur la neurulation crâniens et extension convergente. La sensibilité à ce composé peut être comparée entre les différents mutants génétiques de souris. La méthode présentée ici peut également être appliquée à des études d&#39;autres voies moléculaires dans le développement, permettant la manipulation directe de la fonction cellulaire des embryons en utilisant une variété de réactifs.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commentaires </th></tr><tr><td> Stéréomicroscope pour la dissection </td><td> Leica </td><td> M165 </td><td></td></tr><tr><td> Précision Incubateur </td><td> BTC Engineering (Royaume-Uni) </td><td> BTC 001 </td><td></td></tr><tr><td> Rotation Unité Culture Bouteille </td><td> CTB </td><td> BTC 003 </td><td></td></tr><tr><td> Bouteilles en verre pour unité rotative </td><td> CTB </td><td> BTC 005 </td><td></td></tr><tr><td> Silicone Bung </td><td> CTB </td><td> BTC 007 </td><td></td></tr><tr><td> Silicone Cork </td><td> CTB </td><td> BTC 008 </td><td></td></tr><tr><td> Gaz Bubbler Inlet </td><td> CTB </td><td> BTC 012 </td><td></td></tr><tr><td> Piège d&#39;entrée de gaz Bubbler </td><td> CTB </td><td> BTC 013 </td><td></td></tr><tr><td> Gaz Bubbler sortie </td><td> CTB </td><td> BTC 014 </td><td></td></tr><tr><td> Bouteille de gaz </td><td> TechAir </td><td></td><td> 20% d&#39;O 2, 5% de CO 2 </td></tr><tr><td> Régulateur de gaz </td><td> TechAir </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Sérum de rat mâle </td><td> Harlan Labs </td><td> 4520 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM W / O rouge de phénol </td><td> Invitrogen </td><td> 31053 </td><td></td></tr><tr><td> Seringue de 10 ml </td><td> BD </td><td> 309604 </td><td></td></tr><tr><td> Filtre seringue </td><td> Nalgene </td><td> 190-2545 </td><td></td></tr><tr><td> Grand Ciseaux de dissection (Blunt pourboire) </td><td> VWR </td><td> 82027-594 </td><td></td></tr><tr><td> Extra Fine Ciseaux de Bonn </td><td> Beaux-outils scientifiques (FST) </td><td> 14084-08 </td><td></td></tr><tr><td&gt; Dumot # 5 forceps </td><td> TSF </td><td> 11252-50 </td><td></td></tr><tr><td> Tyrode Saline </td><td></td><td></td><td> Comme décrit dans Cockroft 1990 </td></tr><tr><td> 10 cm vaisselle jetable de Pétri </td><td> BD </td><td> 351029 </td><td></td></tr></tbody></table>

fermeture du tube neural dans la culture mouse embryo entier

Neural Tube Closure in Mouse Whole Embryo Culture

Modèles génétiques de souris sont un outil important dans l&#39;étude de la fermeture du tube neural chez les mammifères (Gray &amp; Ross, 2009; Ross, 2010). Cependant, l&#39;étude des embryons de souris in utero est limité par notre incapacité à manipuler directement pharmacologiquement les embryons dans l&#39;isolement des effets du métabolisme de la mère sur le réactif d&#39;intérêt. Que ce soit en utilisant une petite molécule, protéine recombinante, ou siARN, la livraison de ces substances à la mère, par l&#39;alimentation ou par injection sous réserve de ces composés instables à une variété de défenses corporelles qui pourraient les empêcher d&#39;atteindre l&#39;embryon. Enquêtes dans les cultures d&#39;embryons de l&#39;ensemble peut être utilisé pour séparer la mère du intrinsèques effets sur le fœtus sur le développement. Ici, nous présentons une méthode de culture des embryons de souris en utilisant les médias hautement enrichi dans un appareil à rouleaux incubateur qui permet de fermeture du tube neural normale après dissection (Crockett, 1990). Une fois dans la culture, les embryons peuventêtre manipulées en utilisant des techniques in vitro conventionnelle qui ne serait pas possible autrement si les embryons étaient encore dans l&#39;utérus. Frères et sœurs d&#39;embryon peuvent être recueillies à des moments différents pour étudier les différents aspects de la neurulation, survenant de E7-7.5 (la formation de la plaque neurale, juste avant le début de la neurulation) pour E9.5-10 (à l&#39;issue de neuropore plier et caudale du crâne fermeture, Kaufman, 1992). Dans ce protocole, nous démontrons notre méthode pour disséquer des embryons au timepoints qui sont optimales pour l&#39;étude de la neurulation crânienne. Les embryons seront disséqués à E8.5 (environ 10-12 somities), après l&#39;initiation de la fermeture du tube neural, mais avant de tourner l&#39;embryon et de fermeture crânienne neurones pli, et maintenues en culture jusqu&#39;à E10 (26-28 somities), quand crânienne neurulation doit être complète.

Une méthode permettant la manipulation pharmacologique directe d&#39;embryons de souris au cours neurulation qui contourne le métabolisme de la mère est décrite. La technique peut être adaptée pour étudier les différents aspects de la neurulation en faisant varier le point dans le temps et l&#39;agent pharmacologique.

Fermeture du tube neural dans la culture Mouse Embryo entier

Les modèles murins génétiques constituent un outil important pour l'étude de la fermeture du tube neural chez les mammifères (Gray & Ross, 2009 ; Ross, 2010). Cependant, l'étude de la souris...

L'objectif général de cette procédure est de suivre les événements du développement de l'embryon de souris, notamment l'allongement de l'axe neurogène et la fermeture du tube neural, dans un environnement extramural où les conditions peuvent être définies. Cette approche est réalisée en prélevant d'abord les cornes utérines de la souris gestante anesthésiée au jour 8,5 de gestation ou d'embryogenèse. Ensuite, des embryons de souris individuels sont extraits de l'utérus avec leur sac vitellin intact et une grande partie de la décidue.Ensuite, le tissu décidual extra-embryonnaire est éliminé, en laissant intact le cône ectoplacentaire. La dernière étape de la procédure consiste à transférer les embryons dans leur sac vitellin vers des bouteilles rotatives contenant un milieu avec ou sans agents pharmacologiques testés, puis à cultiver les embryons pendant 18 à 24 heures dans un incubateur avec un apport gazeux continu. En fin de compte, on peut obtenir des résultats montrant une addition progressive des somites, une apposition des plis neuronaux et une fermeture accompagnée d’un repliement de l’embryon en la courbure en « C » caractéristique de la position fœtale.Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine, comme quelles voies moléculaires sont impliquées dans la fermeture normale du tube neural. Quels agents ou suppléments peuvent favoriser une ovulation normale, en particulier chez les embryons porteurs de mutations génétiques les prédisposant à des malformations du tube neural ou NTD. La démonstration visuelle de cette technique est essentielle, car les étapes de la dissection peuvent être très difficiles.Les embryons sont petits et peuvent être facilement endommagés, et tout dommage au sac vitellin peut nuire à la formation des somites ainsi qu'au développement du système circulatoire, empêchant ainsi un résultat satisfaisant. Pour commencer, préparez le milieu de culture en décongelant le sérum de rat mâle à 37 degrés Celsius. Ensuite, inactiver le sérum de rat pendant 30 minutes à 55 degrés Celsius.Ensuite, centrifuger à 10 000 tr/min pendant cinq minutes. À température ambiante, retirer le surnageant et le mélanger dans un rapport un pour un avec du DMEM sans rouge de phénol et riche en glucose. Stériliser le milieu à l’aide d’un filtre à seringue de 0,45 micron.Isolez l'utérus et placez-le dans une boîte de Pétri contenant du sérum physiologique afin de retirer les embryons. Rincez d'abord l'utérus avec du sérum physiologique pour éliminer tout excès de sang, puis retirez tout tissu adipeux excédentaire à l'extérieur. Transférez-le ensuite dans une boîte propre contenant du sérum physiologique de Tyrode à température ambiante afin d'améliorer la visualisation au microscope stéréoscopique, les mains étant stabilisées sur la platine.Utilisez de petites ciseaux ou une pince fine pour séparer l'utérus et isoler chaque embryon. Insérez la pince fine dans l'espace entre la paroi utérine et la décidue, puis retirez délicatement la paroi utérine en appliquant une tension minimale afin d'éviter de rompre la vésicule vitelline. Ensuite, orientez la décidue de manière à ce que le placenta soit dirigé vers l'opposé de vous.Ensuite, effectuez une incision avec la pince le long de la ligne, en séparant la partie foncée du chorion de la partie plus claire, en prenant soin de ne pas couper trop profondément. Terminez la séparation du placenta depuis le sommet du sac choriale.En prenant soin de ne pas déchirer le cône ectoplacentaire ou EPC. À ce stade, la membrane de Riker sur le sac vitellin devrait être visible. Le retrait de la membrane de Riker du sac vitellin est la partie la plus délicate de la procédure, et nécessite de la patience et une main ferme.Afin de retirer délicatement la membrane de Riker sans endommager le sac vitellin sous-jacent, continuer à éliminer toute la décidua. En prenant soin de ne pas percer le sac vitellin, pincer doucement et retirer la membrane de Riker en la décollant du CEP. Si le CEP est endommagé ou séparé du sac vitellin, les embryons ne parviendront pas à effectuer correctement le retournement entre E 8,5 et E 9,5.Une fois que la membrane de Riker a été retirée, l'embryon devrait être facilement visible à travers le sac vitellin. Stadez l'embryon en comptant les somites le long d'un seul côté, en commençant sous la vésicule otique et en terminant à la queue avec des ciseaux. Coupez l'extrémité d'une pipette plastique de transfert pour l'utiliser sur l'embryon sans endommager le sac vitellin.Remplir des bouteilles roulantes propres avec un millilitre de milieu par embryon. Selon le type de bouteilles roulantes utilisé, un maximum de trois à six embryons peut être chargé dans chaque bouteille. À l’aide de la pipette coupée, transférer les embryons dans la bouteille roulante contenant le milieu, en emportant le moins possible de tyros afin de ne pas diluer le milieu.Fixer le bouchon en caoutchouc sur le haut de la bouteille en verre roulante. Insérer les bouteilles dans le tambour de culture roulante de manière à former un joint étanche entre le bouchon et le tambour. Une fois toutes les bouteilles fixées, boucher les alvéoles vides du tambour avec des bouchons en caoutchouc.Ensuite, activez le rouleau. Puis, ouvrez le réservoir de mélange préalable de CO2 O2 et réglez-le à environ deux PSI afin que la vanne de sortie libère une bulle par seconde. Pour les embryons E 8,5 et E 10, utilisez 20 % d’O2 et 5 % de CO2.Veillez à ce que l'incubateur soit réglé à 37 degrés Celsius et couvrez-le ou fermez-le afin que les embryons soient protégés de la lumière. Pour évaluer le développement embryonnaire, examinez-les périodiquement afin d'observer l'ajout de somites, l'avancement du repliement et le degré de fermeture du tube neural après deux à trois heures de culture ; si nécessaire, ajoutez des inhibiteurs pharmacologiques ou d'autres traitements. Lorsque l'incubation est terminée, éteignez le gaz, arrêtez le rouleau et retirez les flacons de l'incubateur.Transférez les embryons dans du tyros ou du PBS dans une boîte de Pétri. Sous le microscope stéréo, le sac vitellin doit présenter un aspect gonflé, un battement cardiaque doit être visible et la circulation doit être apparente. Retirez le sac vitellin de l’embryon en pratiquant une incision près de la CEP et en retournant le sac vitellin et l’amnion par-dessus la tête et le tronc de l’embryon. Coupez le cordon ombilical pour séparer le sac vitellin de l’embryon.Enfin, examiner l'embryon quant au nombre de somites et aux anomalies du tube neural, telles que des plis crâniens ouverts, une fermeture incomplète du visage ou un pore neural caudal ouvert. Les embryons peuvent être classés selon la classification de Tyler, basée sur plusieurs changements morphogénétiques. L'aspect des embryons avant et après la culture sur rouleau est illustré ici au moment de la dissection. L'embryon doit présenter une configuration non retournée, dans laquelle la queue se situe en arrière des plis céphaliques.Après 24 heures en culture, les embryons devraient avoir terminé leur retournement et se trouver en position fœtale courbée en C, avec la queue située devant la tête. Cette image montre, sur la rangée supérieure, le développement d'embryons sans ajout d'inhibiteurs. La rangée inférieure illustre l'effet d'une manipulation pharmacologique à l'aide de l'inhibiteur de la kinase A Y 27632, un inhibiteur connu de l'extension convergente durant l'alation.Cet inhibiteur provoque un raccourcissement des embryons le long de l'axe caudal et inhibe la fermeture du pli neurocrânien. Nos données montrent que des doses croissantes de Y 2 7 6 3 2 altèrent progressivement la fermeture du pli crânien et raccourcissent l'axe corporel, ce qui est compatible avec le rôle de la voie de signalisation en aval. Une fois maîtrisée, la technique de dissection peut être réalisée en 60 à 90 minutes pour une portée de six à douze embryons.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension des étapes nécessaires pour cultiver des embryons de souris de huit jours et demi à dix jours de gestation dans le but d'étudier les mécanismes du développement à un niveau systémique.

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La culture d’embryons entiers de mammifères (WEC) est largement utilisée en tératologie et en biologie du développement. Le sérum de rat immédiatement centrifugé est généralement fourni comme milieu pour le WEC de souris et de rat. Dans cette vidéo, nous démontrons notre protocole standard pour la préparation d’un sérum de rat de haute qualité adapté au WEC des mammifères.

Préparation du Rat Serum Convient pour la culture d&#39;embryons de mammifères entier

Ici, nous présentons une nouvelle technique microchirurgicale pour isoler des cellules souches neurales de l’éminence E13 souris embryon ganglionnaire.

Isolement et Culture des embryons de souris des cellules souches neurales

Ce protocole décrit la dissection et la culture des cellules de crête neurale crânienne des modèles de souris, principalement pour l'étude de la migration cellulaire. Nous décrivons les techniques d'imagerie en direct utilisées et l'analyse des changements de vitesse et de forme cellulaire.

Dissection, culture et analyse des cellules neurales primaires de crête neurale de la souris pour l'étude de la délamination et de la migration neurales de cellules de crête

Ce protocole a été développé pour surveiller longitudinalement les propriétés mécaniques du tissu de la plaque neurale pendant la neurulation de l’embryon de poulet. Il repose sur l’intégration d’un microscope Brillouin et d’un système d’incubation sur scène, permettant l’imagerie mécanique en direct du tissu de la plaque neurale dans des embryons de poussins cultivés ex ovo .

Surveillance de l’évolution mécanique des tissus lors de la fermeture du tube neural d’un embryon de poussin

Découvrez une méthode de culture d'embryons de souris entiers pour étudier la fermeture du tube neural et l'élongation de l'axe neuro. Cette technique permet une manipulation pharmacologique directe en contournant le métabolisme maternel.

Fermeture du tube neural dans la culture Mouse Embryo entier

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