Encyclopédie des expériences JoVE
Neurosciences
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Commencez par une boîte de culture contenant des embryons de poisson-zèbre fécondés dans un milieu embryonnaire.
Placez la boîte sous un stéréomicroscope et utilisez une pince à dissection pour retirer le chorion, la membrane externe entourant les embryons.
Cela permet aux embryons d’être exposés au milieu environnant.
Transférez ces embryons déchorionnés dans une boîte contenant un milieu embryonnaire avec un médicament qui inhibe la synthèse du cholestérol, ce qui est crucial pour maintenir l’intégrité des vaisseaux sanguins du cerveau.
Incuber à température contrôlée jusqu’à ce que les embryons se transforment en larves.
Au fil du temps, le médicament pénètre dans les larves en développement, inhibant la synthèse du cholestérol.
La carence en cholestérol affaiblit les vaisseaux sanguins du cerveau, provoquant leur rupture et une fuite de sang dans le cerveau, développant des taches hémorragiques.
Observez les larves au microscope stéréoscopique.
Séparez les larves hémorragiques, avec des taches rouges distinctes, d’une population non hémorragique.
Transférez ces larves hémorragiques dans un nouveau plat pour des études plus approfondies.
24 heures après la fécondation, sous un stéréomicroscope à fond clair, utilisez une pince à dissection ultramince pour déchorionner les embryons pour le traitement à l’atorvastatine. Ensuite, ajoutez 30 millilitres de milieu embryonnaire E3 dans deux boîtes de Pétri propres, l’une pour le traitement et l’autre pour le contrôle. Retirez 60 microlitres d’eau embryonnaire de la boîte de traitement et ajoutez 60 microlitres d’atorvastatine de 0,5 millimolaire pour obtenir 80 % des larves hémorragiques.
À l’aide d’une pipette Pasteur, transférez 100 embryons dans le moins d’eau possible dans chaque plat. Incuber les deux plats à 28 degrés Celsius. À tout moment après 50 heures après la fécondation, au microscope, utilisez une pipette Pasteur pour séparer soigneusement les poissons hémorragiques des populations non hémorragiques et transférez les larves dans de nouvelles boîtes contenant des milieux E3 frais.
Pour faciliter la séparation des larves positives aux hémorragies, vous pouvez utiliser des poissons sans pigment ou des poissons qui expriment des protéines fluorescentes dans les globules rouges.