Name: Profilage voltage-dépendants expression dARNm de potassium dans les neurones Canal nigrales utilisant une seule cellule de RT-PCR (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 31 s
Description: Découvrez la détection d'ARNm dans les neurones individuels par patch clamp et RT-PCR. Cette méthode permet d'analyser l'expression des canaux ioniques et des récepteurs dans la substantia nigra.

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1. La préparation de tranches de cerveau <ol><li> Jeunes (15-40 jours) mâles et femelles Sprague-Dawley sont utilisés. (Nous utilisons également ce même protocole chez la souris.) Sous anesthésie profonde uréthane, les animaux sont décapités et le cerveau est rapidement disséqué. Puis de 300 um d'épaisseur des tranches de cerveau contenant la partie coronale midrostral du locus niger sont coupés sur une vibratome Leica (VT-1200S). La tranche de coupe procédure est effectuée dans une glace froide, saccharose oxygénée couper solution contenant (en mm): 220 de saccharose, 2,5 KCl, 1,25 NaH 2 PO 4, 25 NaHCO3, 0,5 CaCl2, MgCl2 7, 10 D- glucose. Il fait barboter avec un mélange de 95% de CO O 2 / 5% 2 pour garder oxygénée et maintenir le pH à 7,4. Conserver la solution de coupe glacée pendant toute la procédure. </li><li> Les tranches de cerveau sont incubés dans une chambre d'incubation rempli d'un liquide céphalo-rachidien oxygénée artificiel (ACSF) contenant (en mM): 125 NaCl, KCl 2,5, 1,25 NaH 2 PO 4, 25 NaHCO3, 2,5 CaCl2, 1,3 MgCl 2, 10 D-glucose. Il fait barboter avec un mélange de 95% de CO O 2 / 5% 2 pour garder oxygénée et maintenir le pH à 7,4. La température d'incubation est de 34 ° C pendant 45 min puis à température ambiante jusqu'à ce que la tranche de cerveau est transférée à la chambre d'enregistrement. </li></ol> 2. Empreintes électrophysiologique des neurones nigrales <ol><li> Une tranche de cerveau est transféré à une chambre d'enregistrement patch clamp continuellement perfusées avec le aCSF oxygénée à 32 ° C. </li><li> Pipettes de patch sont retirés de l'autoclave borosilicate (KG-33) tube capillaire en verre (1,10 mm di, 1,65 mm de diamètre extérieur, le roi de précision en verre, de Claremont, Californie) à l'aide d'un tire-PC-10 (Narishige, Tokyo, Japon) et rempli de solution intracellulaire préparés avec de la DNase-eau sans RNase (Fisher Scientific) (contenant 135 mM de KCl, 0,5 mM EGTA, 10 mM HEPES, 1,5 mM MgCl 2, pH ajusté à 7,3). Les pipettes de patch ont des résistances de 2-3 MQ dans le bain. </li><li> La substantia nigra est identifié en fonction de sa localisation anatomique distincte (Fig. 1A1-2). Sous la direction visuelle d'un microscope vidéo (Olympus BX51W1) équipé d'une optique Nomarski et 60X objectif à immersion d'eau, de grandes cellules dans la substance noire pars compacta (SNC) et la substantia nigra pars reticulata (SNR) (possible neurones DA et les neurones GABA) sont sélectionnés pour l'enregistrement. Conventionnel giga-ohms étanchéité configuration cellule entière est obtenue (Fig. 1B1). Courant analyses pince de serrage et de tension peut être effectuée. Afin de minimiser la dégradation de l'ARNm, l'enregistrement électrophysiologique doit être brève (≤ 5 min). Une option consiste à enregistrer seulement la membrane et les propriétés de dopage de fournir des empreintes digitales électrophysiologiques pour les neurones des intérêts (Fig. B2-3). Cet enregistrement ne prend que brève environ 1 min. </li></ol> 3. L'aspiration Cytoplasme <ol><li> Après les empreintes digitales et la caractérisation électrophysiologique des neurones GABA et SNr DA, la bouche d'aspiration douce est appliquée pour aspirer le cytoplasme. Le noyau de la cellule peut aussi être aspiré, résultant de la contamination d'ADN génomique. L'étanchéité ne doit pas être brisée; les débris contraire extracellulaires dont l'ARNm peut être aspiré dans la pipette de patch et de contaminer le contenu de la cellule. L'intégrité de l'étanchéité est bonne tant que l'augmentation du courant de maintien à -70 mV ne dépasse pas 100 pA. </li><li> Ensuite, le contenu de la cellule aspiré est expulsé dans un tube de 0,2 ml par PCR en cassant la pointe de la pipette et une faible pression positive. Un contenu cellulaire est recueilli dans un tube PCR. Après avoir accepté le contenu de la cellule, le tube collecteur PCR, pré-refroidi sur la glace, est immédiatement placé dans un congélateur à -20 ° C. </li><li> Afin d'exclure la contamination de débris extracellulaires qui peuvent contenir des ARNm, la pipette de patch est descendue dans le tissu sans réellement aspirer le cytoplasme, puis le contenu de la pipette est soumis à la RT-PCR. </li></ol> 4. La transcription inverse (RT) <ol><li> Après avoir recueilli le contenu des cellules à partir d'un nombre raisonnable de neurones, habituellement 10-20, RT devrait commencer immédiatement pour minimiser la dégradation des ARNm. </li><li> Puisque la quantité de contenu de la cellule à partir d'un seul neurone est trop petit, la procédure d'isolement d'ARN n'est pas effectuée. Pour retirer l'ADN génomique contaminant potentiels, le contenu de la cellule aspiration est d'abord digéré par la DNase I (5 uL DNase I et 1,6 uL de tampon DNase I, 5 min à 25 ° C). Puis DNase I est inactivé par addition de 1,2 uL 25 mM d'EDTA et incubation à 75 ° C pendant 5 min. </li><li> L'ADNc est synthétisé en utilisant l'exposant III de la transcriptase inverse des cellules à base-Direct kit de synthèse d'ADNc (Invitrogen, tableau 1). Premier volet d'ADNc est synthétisé à 50 ° C pendant 50 min, puis la réaction est inactivée par incubation à 85 ° C pendant 5 min et 1 ul RNase H est d'ajoutered à digérer ARNm (37 ° C pendant 20 min.) L'ADNc simple brin est stocké à -20 ° C pour l'amplification PCR tard. </li><li> L'élimination complète de l'ADN génomique est vérifiée par RT-moins de contrôle dans lequel la transcriptase inverse est omis alors que tous les composants de la réaction d'autres ont été exactement les mêmes. </li></ol> 5. Deux stade de l'amplification par PCR <ol><li> Des amorces ont été conçues selon les séquences dans GenBank. Autant que possible, intron s'étend paires d'amorces ont été utilisées qui permettent de détecter la contamination d'ADN génomique. La paire d'amorces de séquences sont répertoriées dans le tableau 2. L'efficacité des paires d'amorces doivent d'abord être vérifié par les ARNm ensemble du cerveau qui produisent des produits positifs. Toutes les amorces sont synthétisées par Integrated DNA Technologies (Cedar Rapids, Iowa, Etats-Unis). </li><li> Dans la première phase, 5 ul de l'ADNc 30 uL est amplifié pendant 35 cycles en présence du couple d'amorces (tableau 2). Le protocole de cyclage thermique du thermocycleur (Mastercycler, Eppendorf, tableau 1) est de 2 min à 94 ° C pour la dénaturation initiale, puis 35 cycles de 15 s à 94 ° C pour dénaturer, 30 s à 55 ° C à recuire, et 45 s à 72 ° C afin de prolonger, suivis de 7 min pour une extension finale. Taq ADN polymérase, désoxynucléotides triphosphates (dNTPs), et tous les autres éléments nécessaires à l'amplification par PCR sont fournis par un mélange PCR super (Invitrogen, tableau 1) </li><li> Dans la deuxième étape de PCR, le produit de 1 pl de la 1 ère étape d'amplification PCR est utilisé comme modèle et la paire d'amorces même que celui utilisé dans la première étape est utilisé (tableau 2). 40 cycles sont organisées avec le temps d'extension réduite à 30 s. Le même PCR Super Mix est utilisé. </li><li> Les produits de PCR de l'amplification 2 ème étape sont séparés par électrophorèse sur gel d'agarose 2,5%, visualisée par le bromure d'éthidium (0,05 mg/100 ml de gel) ou gelgreen sous lumière UV, et photographié (fig. B4). Les bandes positives sont ensuite découpés, extraits en utilisant un kit d'extraction Qiagen (tableau 1) et séquencé et comparé avec les séquences publiées des gènes cibles. </li></ol> 6. Les résultats représentatifs: La dopamine (DA) des neurones dans le substantia nigra pars compacta et pars reticulata et les neurones voisins de projection GABA dans la substantia nigra pars reticulata ont distinctes caractéristiques électrophysiologiques (Zhou et al 2006;. Ding et al 2011).. Comme le montre la Fig. 1B2, SNR neurones GABA présentent dopage à haute fréquence spontanée autour de 10 Hz. Les pics ont une durée de base d'environ 1 ms. Sur hyperpolarisante injection de courant, SNR neurones GABA afficher un affaissement faibles dépolarisants en réponse à hyperpolarisante injection de courant, indiquant une faible expression du courant I h dans ces neurones (fig. 1B2). En revanche, les neurones DA nigrales présentent des basses fréquences (autour de 2 Hz) des pointes spontanées qui ont une durée de base autour de 3 ms. Neurones DA montrent également qu'un affaissement prononcé en réponse à hyperpolarisante injection de courant, indiquant une forte expression de I h de courant (Fig. 1B3) (Zhou et al 2006;.. Ding et al 2011). SCRT-PCR détecté l'ARNm pour l'acide glutamique décarboxylase 1 (GAD1, l'enzyme clé pour la synthèse de GABA et un marqueur de neurones GABA) dans électrophysiologique des neurones identifiés SNr GABA, mais pas dans les neurones DA (fig. 1B4, 5). En revanche, les SCRT-PCR détecté l'ARNm de la tyrosine hydroxylase (TH, enzyme clé pour la synthèse de dopamine et un marqueur de neurones DA) en électrophysiologie identifié SNC et SNr neurones DA, mais pas dans les neurones GABA (fig. 1B4, 5). Alors SCRT-PCR résultats confirment l'identification de neurones électrophysiologiques. Ensuite, SCRT-PCR a été utilisé pour le profil de l'expression de la tension sous-unités activées KV3 canal, Kv3.1, Kv3.2, Kv3.3 et Kv3.4. Ces sous-unités contribuent à former voltage-dépendants canaux K + de propriétés diverses selon la composition sous-unité (Ding et al. 2011). Dans l'exemple SNr GABA neurone Fig. 1B4, ARNm de Kv3.1, Kv3.2, Kv3.3 et Kv3.4 ont été détectés. Dans l'exemple SNr DA neurone indiqué dans Fig.1B5, seulement Kv3.2, Kv3.3 et Kv3.4 ont été détectés. Dans nos données en commun, Kv3.1 a été plus fréquemment détectés dans les neurones GABA SNr que dans les neurones DA nigrales, indiquant un niveau élevé d'expression des Kv3.1 dans les neurones rapide dopage SNr GABA (Ding et al. 2011). <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3136/3136fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Identification électrophysiologique des neurones GABA SNr et nigrales neurones DA A:.. Les zones nigrales peuvent être identifiés par leur localisation anatomique distincte A1 indique l'emplacement de la SNC et SNR dans une coronale Nissl teinté section capturé avec un objectif 1X. La zone encadrée est CAPTURED avec un objectif 10X et affiché dans le milieu, comme indiqué par la flèche. La SNC-cellulaire riche et pauvre en cellules SNR sont clairement visibles. A2 indique l'emplacement de la SNC et SNR en direct, coupe coronale non colorées capturées avec un objectif 4X. La SNC-cellulaire riche et pauvre en cellules SNr sont aussi clairement identifiables. VTA, l'aire tegmentale ventrale. B1 montre un SNR GABA neurone pièce étant serrée dans la cellule entière mode. B2 montre les propriétés typiques électrophysiologiques des neurones GABA SNr en mode pince enregistrement en cours. Ces incendies spontanés neurones potentiels d'action à haute fréquence de courte durée et ont une faible réponse, je sag h à médiation hyperpolarisante injection de courant. B3 montre typique de propriétés électrophysiologiques des neurones DA nigrales en mode pince enregistrement en cours. Ils incendie spontané à faible fréquence de potentiels d'action de longue durée et ont un éminent I h à médiation affaissement (tête de flèche) réponse à hyperpolarisante injection de courant. Ainsi, SNR neurones GABA et les neurones dopaminergiques nigrales sont clairement identifiés électrophysiologique. B4 montre une image du gel des SCRT-PCR à partir d'un neurone électrophysiologiques identifié SNr GABA. Glutamate décarboxylase 1 (GAD1) ​​mais pas de l'ARNm de la tyrosine hydroxylase (TH) ARNm a été détecté. ARNm de Kv3.1, Kv3.2, Kv3.3 et Kv3.4 ont été détectés dans ce neurone SNr GABA. B5 montre SCRT-PCR de détection des ARNm de canal neuronale KV3 dans un neurone SNr DA. ARNm TH mais pas l'ARNm GAD1 a été détecté dans une électrophysiologique des neurones identifiés SNr DA. ARNm de Kv3.2, Kv3.3 et Kv3.4 ont été détectés dans cette SNr DA neurone. B6 montre les données regroupées. 7. Potentiel de faux négatifs et de faux résultats positifs Basé sur notre expérience, plusieurs facteurs peuvent conduire à des faux négatifs SCRT-PCR. Ces facteurs comprennent l'échec de l'aspiration quantité suffisante du cytoplasme à cause de colmatage pointe de la pipette de patch, la contamination de RNase, et inefficace amorces de PCR. Colmatage Patch pointe de la pipette en général peut être vu sur le moniteur vidéo et indiqué par un accès accru de résistance. Contamination de RNase peuvent être évités par la désactivation complète et porter des gants. L'efficacité d'amorces PCR doivent être testés en utilisant l'ARN total à partir d'un tissu cérébral poinçon (Zhou et al 2008;.. Ding et al 2011). Depuis que nous utilisons toujours la DNase d'abord traiter nos échantillons avant la RT, nous n'avons pas rencontré de faux résultats positifs. Théoriquement, sans digestion par la DNase, la contamination d'ADN génomique et donc fausse détection positive peut se produire lorsque le gène est intron ou la paire d'amorces ne couvre pas la région intron.

<ol><li>J, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+pacemaker+frequency+of+individual+dopaminergic+neurons+by+Kv4.3L+and+Kchip3.1+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Tuning pacemaker frequency of individual dopaminergic neurons by Kv4.3L and Kchip3.1 transcription.</a> EMBO J. 20, 5715-5724 (2001).</li>
<li>Surmeier, D. J., Song, W. J., Yan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+expression+of+dopamine+receptors+in+neostriatal+medium+spiny+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Coordinated expression of dopamine receptors in neostriatal medium spiny neurons.</a> J. Neurosci. 16, 6579-6591 (1996).</li>
<li>Zhou, F. W., Matta, S. G., Zhou, F. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constitutively+active+TRPC3+channels+regulate+basal+ganglia+output+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Constitutively active TRPC3 channels regulate basal ganglia output neurons.</a> J. Neurosci. 28, 473-482 (2008).</li>
<li>Zhou, F. W., Jin, Y., Matta, S. G., Xu, M., Zhou, F. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ultra-short+dopamine+pathway+regulates+basal+ganglia+output+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">An ultra-short dopamine pathway regulates basal ganglia output neurons.</a> J. Neurosci. 29, 10424-10435 (2009).</li>
<li>Ding, S., Matta, S. G., Zhou, F. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kv3-like+potassium+channels+are+required+for+sustained+high-frequency+firing+in+Basal+Ganglia+output+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Kv3-like potassium channels are required for sustained high-frequency firing in Basal Ganglia output neurons.</a> J. Neurophysiol. 105, 554-570 (2011).</li>
<li>Zhou, F. W., Xu, J. J., Zhao, Y., Ledoux, M. S., Zhou, F. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opposite+functions+of+histamine+H1+and+H2+receptors+and+H3+receptors+in+substantia+nigra+pars+reticulata%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Opposite functions of histamine H1 and H2 receptors and H3 receptors in substantia nigra pars reticulata.</a> J. Neurophysiol. 96, 1581-1591 (2006).</li>
</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

La combinaison de l&#39;enregistrement de patch clamp en tranches de cerveau avec des SCRT-PCR, nous avons démontré ici fournissent une excellente méthode pour étudier les profils d&#39;expression d&#39;ARNm pour les canaux ioniques, récepteurs et des enzymes clés de la synthèse des neurotransmetteurs dans les neurones individuellement caractérisés. Ceci est particulièrement utile lorsque la protéine en question ne peuvent être détectées et localisées à l&#39;aide d&#39;autres méthodes telles que l&#39;immunohistochimie...

<img src="/files/ftp_upload/3136/3136table1.jpg" alt="Tableau 1"> Réactifs clés Tableau 1. Et de l'équipement <img src="/files/ftp_upload/3136/3136table2.jpg" alt="Tableau 2"> Tableau 2. Paires d'amorces pour le rat neuronale KV3 canal, la tyrosine hydroxylase (TH) et l'acide glutamique décarboxylase 1 (GAD1) ​​ARNm de SCRT-PCR

profilage voltage-dépendants expression d&#39;arnm de potassium dans les neurones canal nigrales utilisant une seule cellule de rt-pcr

Profiling Voltage-gated Potassium Channel mRNA Expression in Nigral Neurons using Single-cell RT-PCR Techniques

Dans le système nerveux central des mammifères, les différents types de neurones avec diverses caractéristiques moléculaires et fonctionnelles sont entremêlés les uns avec les autres, difficiles à séparer et également pas facilement identifiables par leur morphologie. Ainsi, il est souvent difficile d&#39;analyser l&#39;expression génique dans un type de neurone spécifique. Ici, nous documenter une procédure qui combine les techniques de la cellule entière patch clamp enregistrement avec une seule cellule de réaction transcription inverse polymérase (SCRT-PCR) pour le profil d&#39;expression d&#39;ARNm dans différents types de neurones dans le locus niger substantielle. Les techniques électrophysiologiques sont d&#39;abord utilisés pour enregistrer les propriétés neurophysiologiques et fonctionnelle des neurones individuels. Ensuite, le cytoplasme des neurones seule électrophysiologiquement caractérisé nigrales est aspiré et soumis à des SCRT-PCR pour obtenir des profils d&#39;expression d&#39;ARNm des enzymes de synthèse de neurotransmetteurs, les récepteurs et canaux ioniques. La sélectivité et une sensibilité élevées rendent cette méthode particulièrement utile lorsque l&#39;immunohistochimie ne peut pas être utilisée en raison d&#39;un manque d&#39;anticorps approprié ou le niveau faible expression de la protéine. Cette méthode est également applicable à des neurones dans des zones du cerveau.

Les neurones sont d&#39;abord caractérisé électrophysiologique. Puis le cytoplasme du neurone enregistré est aspiré et soumis à une transcription inverse-PCR afin de détecter l&#39;expression des ARNm des enzymes de synthèse des neurotransmetteurs, des canaux ioniques et les récepteurs.

Profilage voltage-dépendants expression d&#39;ARNm de potassium dans les neurones Canal nigrales utilisant une seule cellule de RT-PCR

Dans le système nerveux central des mammifères, différents types de neurones présentant des caractéristiques moléculaires et fonctionnelles diverses sont entremêlés, ...

L'objectif général de cette procédure est de détecter les ARN messagers dans des neurones individuels. Cela est réalisé en effectuant un enregistrement par patch-clamp sur des neurones individuels, puis en aspirant complètement le cytoplasme de chaque neurone enregistré, contenant l'ARNm et le cytoplasme. L'ADNc est ensuite synthétisé et amplifié par PCR.En fin de compte, des ARNm spécifiques pour des récepteurs, des canaux ioniques et des enzymes peuvent être détectés à l’aide d’un système classique d’imagerie sur gel. Je m’appelle, je travaille au Centre des sciences de la santé de l’Université du Tennessee. En général, les personnes novices dans cette méthode éprouvent des difficultés, car la quantité d’ARNm dans un seul neurone est extrêmement faible et peut facilement être perdue.Commencez ce protocole en utilisant un vibrotome pour découper des tranches coronales de cerveau d'une épaisseur de 300 micromètres contenant la partie mésencéphalique rostro-médiane de la substance noire. Les cerveaux peuvent être isolés de rats Sprague-Dawley âgés de 15 à 40 jours. La procédure de découpe des tranches est réalisée à froid, dans une solution de coupe riche en saccharose, oxygénée avec un mélange à 95 % d'oxygène et 5 % de dioxyde de carbone, et à un pH de 7,4. Incubez les tranches dans un liquide céphalorachidien artificiel saturé avec un gaz à 5 % de dioxyde de carbone et 95 % d'oxygène.Conserver la température à 34 degrés Celsius et laisser les tranches pendant 45 minutes. Ensuite, maintenir les tranches de cerveau à température ambiante jusqu'à l'enregistrement. Commencer par transférer une tranche de cerveau dans une chambre d'enregistrement de patch clamp.Perfuser en continu avec un liquide céphalo-rachidien artificiel oxygéné à 32 degrés Celsius. Remplir les pipettes de patch avec une solution intracellulaire autoclavée préparée à l’aide d’eau exempte d’ADN et d’ARN. Abaisser une pipette chargée dans le bain.Vérifiez que la résistance se situe entre deux et trois mégaohms. Localisez d'abord la substance noire par sa position anatomique distincte. Ensuite, à l'aide d'optiques Namar et d'un objectif 60 x, sélectionnez les grandes cellules de la SNC et de la SNR pour l'enregistrement.Il s'agit sans hésitation possible de neurones dopaminergiques ou GABAergiques. Utilisez une configuration conventionnelle de type tout-cellule avec scellement étanche de l'ordre du gigaohm pour effectuer des enregistrements en mode potentiométrique et en mode ampèremétrique. Ces enregistrements doivent généralement être réalisés en moins de cinq minutes afin de minimiser la dégradation de l'ARNm.En environ une minute, il est possible d'obtenir des empreintes électrophysiologiques pour les neurones d'intérêt en enregistrant uniquement leurs propriétés membranaires et de décharge. Après avoir obtenu les données d'un neurone d'intérêt, appliquez une aspiration douce par la bouche pour aspirer le cytoplasme. Le scellement étanche ne doit pas être rompu, sinon.Les débris extracellulaires, notamment l'ARNm, peuvent être aspirés dans la pipette de patch et contaminer le contenu cellulaire. Expulsez le contenu cellulaire dans un tube PCR de 0,2 millilitre en brisant l'extrémité de la pipette et en appliquant une légère pression positive. Une fois terminé, placez immédiatement le tube dans un congélateur à moins 20 pour éliminer tout risque de contamination par des débris extracellulaires pouvant contenir des ARNm.Préparez un témoin négatif en recueillant le contenu d'une micropipette appliquée sur le tissu sans aspiration. Dès que le contenu cellulaire provenant de 10 à 20 neurones a été recueilli, commencez immédiatement la réaction de transcription inverse. Pour minimiser la dégradation des ARNm, commencez par digérer tout ADN génomique contaminant à l'aide de DNase, pendant cinq minutes à 25 degrés Celsius.Cette étape est cruciale pour réduire les faux positifs potentiels et ne doit pas être contournée. Ensuite, inactiver l'ADN en ajoutant 1,2 microlitre de EDTA à 25 millimolaire et incuber les échantillons à 70 degrés Celsius pendant cinq minutes. Utilisez maintenant un kit disponible dans le commerce pour synthétiser l'ADN complémentaire afin de vérifier que l'ADN génomique a été complètement éliminé.Effectuez une réaction témoin pour chaque échantillon sans transcriptase inverse. Tous les autres composants de la réaction restant identiques. Conservez les produits à moins 20 degrés Celsius jusqu'à ce qu'ils soient nécessaires pour la conception de la PCR.Des amorces conçues selon les séquences présentes dans GenBank, chaque fois que possible, doivent présenter une modification T intro chevauchant les réparations d'amorces afin de faciliter la détection d'une contamination par de l'ADN génomique. Pour vérifier l'efficacité des paires d'amorces, testez-les sur de l'ADNc de cerveau entier au premier stade. Amplifiez par PCR cinq microlitres des 30 microlitres d'ADNc pendant 35 cycles en utilisant un protocole standard de cyclage thermique.Pour la deuxième étape, amplifiez par PCR un microlitre du produit de la première étape de PCR avec l'enzyme Prime Repair, en utilisant un profil de cyclage légèrement modifié. Séparez ensuite les produits sur un gel d'agarose à 2,5 % et visualisez-les à l'aide de bromure d'ethidium ou de Gel Green. Sous lumière UV, excisez les bandes d'ADN positives et séquençez-les à l'aide d'un kit disponible commercialement afin d'isoler l'ADN.Les caractéristiques électrophysiologiques des neurones de la substance noire, pars compacta et pars reticulata, ont été comparées. Les neurones GABAergiques du SNR présentaient une fréquence plus élevée de décharges spontanées d'environ 10 hertz. Les potentiels d'action avaient une durée de base d'environ un milliseconde lors de l'injection d'un courant hyperpolarisant.Les neurones GABAergiques du SNR présentaient une réponse SAG subtile, indiquant un courant faiblement activé. En revanche, les neurones dopaminergiques nigraux exhibaient des sursauts spontanés de faible fréquence, avec une durée de base d'environ trois millisecondes. Les neurones dopaminergiques montraient également une SAG prononcée en réponse à l'hyperpolarisation, indiquant une forte expression du courant IH dans les neurones GABAergiques du SNR, mais pas dans les neurones dopaminergiques.La R-T-P-C-R à cellule unique a détecté l'ARNm de la glutamate décarboxylase 1, une enzyme clé de la synthèse du GABA. En revanche, une SNC et des neurones dopaminergiques du SNR ont été identifiées, mais pas les neurones GABAergiques. La R-T-P-C-R à cellule unique a détecté l'ARNm de la tyrosine hydroxylase, une enzyme clé de la synthèse de la dopamine.Ensuite, la R-T-P-C-R à cellule unique a été utilisée pour analyser l'expression des sous-unités du canal KV trois activé par le voltage, qui modulent les propriétés des canaux potassium dépendants du voltage. Dans l'exemple de neurone SNR gaba, les ARNm de neurones KV 3.1, 3.2, 3.3 et 3.4 ont été détectés uniquement dans un neurone S-N-R-D-A représentatif. KV 3.2, 3.3 et 3.4 ont été détectés dans les données regroupées.KV 3.1 a été détecté plus fréquemment dans les neurones GABAergiques de la SNR que dans les neurones dopaminergiques nigraux, indiquant un niveau d'expression plus élevé de KV 3.1 dans les neurones GABA de la SNR à décharge rapide. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler de porter des gants et de maintenir les outils exempts de contamination après leur mise au point. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs du domaine des neurosciences pour explorer l'expression et la fonction des récepteurs ainsi que des canaux ioniques dans le système nerveux.

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Nous décrivons une méthode pour trier des cellules de mammifères uniques et quantifier l’expression d’un maximum de 96 gènes cibles d’intérêt dans chaque cellule. Cette méthode comprend l’utilisation de normes qPCR internes pour permettre l’estimation du nombre absolu de transcrits.

Unicellulaire profil d&#39;expression génique utilisant FACS et qPCR avec les normes internes

Ce protocole décrit les étapes critiques et les précautions nécessaires afin d’effectuer seule cellule transcription réverse multiplex PCR après patch clamp. Cette technique est une méthode simple et efficace pour analyser le profil d’expression d’un ensemble prédéterminé de gènes d’une cellule unique, caractérisé par des enregistrements de patch clamp.

Monocellulaire Multiplex Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction après Patch-clamp

Ce protocole explique comment collecter des neurones uniques, des microglies et des astrocytes du noyau central de l’amygdale avec une grande précision et une spécificité anatomique à l’aide de la microdissection de capture laser. En outre, nous expliquons notre utilisation de microfluidique RT-qPCR pour mesurer un sous-ensemble du transcriptome de ces cellules.

Combiner la microdissection de capture laser et le QPCR microfluidique pour analyser les profils transcriptionnels des cellules uniques : une approche de biologie des systèmes à la dépendance aux opioïdes

Différentes régions cérébelleuses ont été impliquées pour jouer un rôle dans des résultats comportementaux distincts, mais les mécanismes moléculaires sous-jacents restent inconnus. Ce travail décrit une méthode pour disséquer de manière reproductible et rapide le cortex cérébelleux des hémisphères, les régions antérieures et postérieures du vermis et les noyaux cérébelleux profonds afin de sonder les différences moléculaires en isolant l’ARN et en testant les différences dans l’expression des...

Dissection régionale cérébelleuse pour l’analyse moléculaire

Cette étude présente une méthode robuste pour isoler les ARNm axonaux à l’aide d’inserts membranaires poreux, permettant la séparation totale des neurones par rapport aux neurites et la purification de l’ARN. Combiné à RTddPCR, cette approche permet une quantification absolue des transcrits à faible copie, facilitant les études sur le transport et la traduction locale de l’ARNm avec une grande sensibilité, une grande reproductibilité et une large applicabilité expérimentale.

Isolement et quantification des ARNm axonaux à l’aide d’inserts membranaires poreux et RTddPCR

Découvrez la détection d'ARNm dans les neurones individuels par patch clamp et RT-PCR. Cette méthode permet d'analyser l'expression des canaux ioniques et des récepteurs dans la substantia nigra.

Profilage voltage-dépendants expression dARNm de potassium dans les neurones Canal nigrales utilisant une seule cellule de RT-PCR (Vidéo) | JoVE Journal

Profilage voltage-dépendants expression d'ARNm de potassium dans les neurones Canal nigrales utilisant une seule cellule de RT-PCR

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