Profilage voltage-dépendants expression d'ARNm de potassium dans les neurones Canal nigrales utilisant une seule cellule de RT-PCR

L'objectif général de cette procédure est de détecter les ARN messagers dans des neurones individuels. Cela est réalisé en effectuant un enregistrement par patch-clamp sur des neurones individuels, puis en aspirant complètement le cytoplasme de chaque neurone enregistré à partir de l'ARNm et du cytoplasme. L'ADNc est ensuite synthétisé et amplifié par PCR.

En fin de compte, des ARNm spécifiques pour des récepteurs, des canaux ioniques et des enzymes peuvent être détectés à l’aide d’un système d’imagerie sur gel classique. Je m’appelle, je travaille au Centre des sciences de la santé de l’Université du Tennessee. En général, les personnes novices dans cette méthode éprouvent des difficultés, car la quantité d’ARNm dans un seul neurone est extrêmement faible et facilement perdue.

Commencez ce protocole en utilisant un vibrotome pour découper des tranches coronales de cerveau de 300 micromètres d'épaisseur contenant la partie mésencéphalique rostro-médiane de la substance noire. Les cerveaux peuvent être isolés de rats Sprague-Dawley âgés de 15 à 40 jours. La procédure de découpe des tranches est réalisée à froid, dans une solution de coupe riche en saccharose, oxygénée avec un mélange de 95 % d’oxygène et de 5 % de dioxyde de carbone, et à un pH de 7,4. Incubez les tranches dans un liquide céphalorachidien artificiel et boratez-les avec un mélange gazeux composé de 5 % de dioxyde de carbone et de 95 % d’oxygène.

Conserver la température à 34 degrés Celsius et laisser les tranches pendant 45 minutes. Ensuite, maintenir les tranches cérébrales à température ambiante jusqu'à l'enregistrement. Commencer par transférer une tranche cérébrale dans une chambre d'enregistrement de patch clamp.

Perfuser continuellement avec un liquide céphalorachidien artificiel oxygéné à 32 degrés Celsius. Remplir les pipettes de patch avec une solution intracellulaire autoclavée préparée à l’aide d’eau exempte d’ADN et d’ARN. Abaisser une pipette chargée dans le bain.

Vérifiez que la résistance se situe entre deux et trois mégaohms. Localisez d'abord la substance noire par sa position anatomique distincte. Ensuite, à l'aide d'optiques Namar et d'un objectif 60 x, sélectionnez les grandes cellules de la SNC et de la SNR pour l'enregistrement.

Il s'agit sans aucun doute possible de neurones dopaminergiques ou GABAergiques. Utilisez une configuration classique de type cellule entière avec scellement étanche de l'ordre du gigaohm pour effectuer des enregistrements en mode potentiométrique et en mode galvanométrique. Ces enregistrements doivent généralement être réalisés en moins de cinq minutes afin de minimiser la dégradation de l'ARNm.

En environ une minute, il est possible d'obtenir des empreintes électrophysiologiques pour les neurones d'intérêt en enregistrant uniquement leurs propriétés membranaires et de décharge. Après avoir obtenu les données d'un neurone d'intérêt, utilisez une aspiration douce par la bouche pour aspirer le cytoplasme. Le scellé étanche ne doit pas être rompu, sinon.

Les débris extracellulaires, y compris l'ARNm, peuvent être aspirés dans la pipette de patch et contaminer le contenu cellulaire. Expulsez le contenu cellulaire dans un tube PCR de 0,2 millilitre en brisant l'extrémité de la pipette et en appliquant une légère pression positive. Une fois terminé, placez immédiatement le tube dans un congélateur à moins 20 pour éliminer toute contamination par des débris extracellulaires pouvant contenir des ARNm.

Préparez un témoin négatif en recueillant le contenu d'une micropipette de patch insérée dans le tissu sans appliquer d'aspiration. Dès que le contenu cellulaire a été recueilli à partir de 10 à 20 neurones, commencez immédiatement la réaction de transcription inverse. Pour minimiser la dégradation des ARNm, commencez par digérer tout ADN génomique contaminant à l'aide de DNAses, pendant cinq minutes à 25 degrés Celsius.

Cette étape est cruciale pour réduire les faux positifs potentiels et ne doit pas être contournée. Ensuite, inactiver les ADN en ajoutant 1,2 microlitre de EDTA à 25 millimolaire et incuber les échantillons à 70 degrés Celsius pendant cinq minutes. Utilisez maintenant un kit disponible dans le commerce pour synthétiser l'ADN complémentaire afin de vérifier que l'ADN génomique a été complètement éliminé.

Effectuez une réaction témoin pour chaque échantillon sans transcriptase inverse. Tous les autres composants de la réaction restant identiques. Conservez les produits à moins 20 degrés Celsius jusqu'à ce qu'ils soient nécessaires pour la conception de la PCR.

Des amorces conformes aux séquences indiquées dans GenBank, chaque fois que possible, doivent être conçues de manière à chevaucher un site d'intron afin de faciliter la détection d'une contamination par de l'ADN génomique. Pour vérifier l'efficacité des paires d'amorces, testez-les sur de l'ADNc de cerveau entier au premier stade. Amplifiez par PCR cinq microlitres des 30 microlitres d'ADNc pendant 35 cycles en utilisant un protocole standard de cyclage thermique.

Pour la deuxième étape, amplifiez par PCR un microlitre du produit de la première étape PCR avec le même réparation d'amorces et utilisez un profil de cyclage légèrement modifié. Séparez maintenant les produits sur un gel d'agarose à 2,5 % et visualisez-les à l'aide de bromure d'ethidium ou de Gel Green. Sous lumière UV, excisez les bandes d'ADN positives et séquençez-les à l'aide d'un kit disponible commercialement afin d'isoler l'ADN.

Les caractéristiques électrophysiologiques des neurones de la substance noire, pars compacta et pars reticulata, ont été comparées. Les neurones GABAergiques du SNR présentaient une fréquence plus élevée de décharges spontanées d'environ 10 hertz. Les potentiels d'action avaient une durée de base d'environ un milliseconde lors de l'injection d'un courant hyperpolarisant.

Les neurones GABAergiques du SNr présentaient une réponse SAG subtile, indiquant un courant faiblement activé. En revanche, les neurones dopaminergiques nigraux exhibaient des potentiels d'action spontanés de faible fréquence, avec une durée de base d'environ trois millisecondes. Les neurones dopaminergiques montraient également un SAG prononcé en réponse à l'hyperpolarisation, indiquant une forte expression du courant IH dans les neurones GABAergiques du SNr, mais pas dans les neurones dopaminergiques.

La R-T-P-C-R individuelle a détecté l'ARNm de la glutamate décarboxylase 1, une enzyme clé de la synthèse du GABA. En revanche, un neurone dopaminergique identifié dans la SNc et la SNr, mais pas dans les neurones GABAergiques. La R-T-P-C-R individuelle a détecté l'ARNm de la tyrosine hydroxylase, une enzyme essentielle à la synthèse de la dopamine.

Ensuite, la R-T-P-C-R à cellule unique a été utilisée pour analyser l'expression des sous-unités des canaux KV trois activés par le voltage, qui modulent les propriétés des canaux potassiques activés par le voltage. Dans l'exemple SNR gaba, des ARNm de neurones pour KV 3.1, 3.2, 3.3 et 3.4 ont été détectés uniquement dans un neurone S-N-R-D-A représentatif. KV 3.2, 3.3 et 3.4 ont été détectés dans les données regroupées.

KV 3.1 a été détecté plus fréquemment dans les neurones GABAergiques de la SRN que dans les neurones dopaminergiques nigraux, indiquant un niveau d'expression plus élevé de KV 3.1 dans les neurones GABA de la SRN à décharge rapide. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler de porter des gants et de maintenir les outils exempts de contamination après leur mise au point. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs du domaine des neurosciences pour explorer l'expression et la fonction des récepteurs ainsi que des canaux ioniques dans le système nerveux.