Marquage et transplantation à médiation virale de cellules d’éminence ganglionnaire médiale pour des études in vivo

Récoltez le tissu de l’éminence ganglionnaire médiale, contenant les progéniteurs de l’interneurone cortical, à partir d’embryons de souris génétiquement modifiés.

Ajoutez un polymère cationique et dissociez le tissu en une suspension unicellulaire.

Ajouter des vecteurs lentiviraux porteurs d’un rapporteur GFP dépendant de la recombinase Cre flanqué de sites lox. Couver.

Le polymère neutralise les charges membranaires virales et cellulaires de l’hôte, permettant la fusion virale et la libération d’ARN.

L’ARN viral est retranscrit et intégré dans le génome de l’hôte.

Centrifugez et jetez le surnageant. Absorbez l’excès de média.

Transférez les cellules sur une surface hydrophobe et chargez-les dans un dispositif d’injection.

Injectez les cellules dans le cortex d’un chiot souris anesthésié.

Laissez le chiot récupérer et grandir.

Les progéniteurs transplantés se différencient en interneurones matures dans le cortex.

Un sous-groupe de ces interneurones co-exprime la Cre recombinase et la RFP.

Dans ces interneurones, Cre excise les sites lox, retournant le gène GFP et permettant son expression.

Visualisez la co-expression RFP et GFP pour identifier les interneurones exprimant Cre.

Après avoir préparé le lentivirus et disséqué le MGE selon les instructions du protocole écrit, prélevez les deux hémisphères du MGE et placez le tissu dans deux tubes de prélèvement de 1,5 millilitre contenant 500 microlitres de DMEM avec 10 % de FBS.

Conservez les échantillons sur de la glace jusqu’à ce que tous les tissus soient recueillis. Transférez ensuite les tubes dans une hotte certifiée BSL-2. Aspirez soigneusement le média sans déranger les tissus MGE déposés au fond du tube.

Ajoutez ensuite environ 500 microlitres de DMEM préchauffé avec un média FBS à 10 %. Ajoutez du polybrène à une concentration finale de 8 microgrammes par millilitre et titrez à l’aide d’une pointe de pipette P1000 jusqu’à l’obtention d’une suspension unicellulaire. Ensuite, ajoutez 15 à 20 microlitres de lentivirus concentré dans chaque tube.

Ensuite, fermez bien chaque tube, retournez-le pour mélanger, puis placez tous les tubes dans un incubateur à 37 degrés Celsius. Incuber les cellules avec le lentivirus pendant au moins 30 minutes, mais pas plus d’une heure, car des temps plus longs ont entraîné une diminution de la viabilité cellulaire. Retournez les tubes toutes les 10 minutes.

Après l’incubation, retirez les tubes de l’incubateur et centrifugez à 700 fois g à 4 degrés Celsius pendant trois minutes pour granuler les cellules. Dans la hotte BSL-2, retirez le surnageant et jetez-le dans de l’eau de Javel à 10 %. Ensuite, ajoutez 1 millilitre de DMEM avec 10 % de FBS et titrez la pastille deux à trois fois pour la laver.

Après la centrifugation comme précédemment, répétez cette étape de lavage deux à trois fois de plus pour éliminer l’excès de virus. Après le lavage final, retirez autant de support que possible et placez chaque tube sur de la glace.

En raison des milieux résiduels sur les côtés du tube, environ 2 à 3 microlitres de milieux finiront par recouvrir la pastille cellulaire, au moment où la procédure de transplantation a commencé. Tout en veillant à ce que la technique stérile soit utilisée tout au long de l’opération, prélevez de l’huile minérale dans une seringue de 1 millilitre, puis avec une aiguille de calibre 30,5, remplissez complètement la pipette en verre avec l’huile minérale.

Ensuite, fixez la pipette en verre à l’appareil stéréotaxique et chargez-la sur le piston. Avec un assistant utilisant l’entraînement hydraulique, déplacez le piston à mi-chemin dans la pipette en verre, en enlevant l’huile minérale qui se déverse avec une serviette en papier propre.

Ensuite, tordez le coin d’une serviette en papier stérile en une pointe fine et utilisez-la pour retirer délicatement l’excès de milieu au-dessus de la pastille de cellule MGE. Cela concentrera la densité cellulaire afin d’obtenir des volumes d’injection plus petits.

Ensuite, à l’aide d’une pipette P2, aspirez lentement la pastille cellulaire et titrez-la une à deux fois avant de la distribuer sur une surface hydrophobe. Le volume doit être d’un peu moins de 1 microlitre.

Déplacez la pointe de l’aiguille dans la suspension cellulaire et, à l’aide de l’entraînement hydraulique, aspirez la suspension cellulaire dans la pipette. Après avoir anesthésié un chiot par hypothermie, vérifiez l’efficacité de l’anesthésie en pinçant la peau entre les orteils avec des pinces. Aucune réaction ne doit être observée.

Ensuite, placez le chiot sur un moule qui se trouve sous le dispositif d’injection et tendez la peau en tirant sur la peau de la tête, puis en la fixant avec du ruban adhésif de laboratoire standard. En travaillant rapidement, manipulez le bras stéréotaxique pour positionner la pointe de la pipette en verre sur la tête du chiot, perpendiculairement à la surface de la tête.

Lorsque la pipette est en contact avec la tête, considérez qu’il s’agit d’un zéro. Ensuite, poussez la pipette à travers la surface de la peau et du crâne dans le cortex. Ensuite, insérez et rétractez la pipette deux fois avant de l’arrêter.

Pour cibler les cellules dans le néocortex, les injections sont effectuées lorsque la micropipette se trouve à une profondeur de 0,1 millimètre. Une fois l’aiguille en place, faites pivoter le dispositif hydraulique pour faire avancer le piston dans la pipette en verre, et injectez 50 à 70 nanolitres par site.

Répétez cette procédure à trois à six sites différents à différents niveaux rostral-caudaux si une large distribution de cellules transformées dans le néocortex est nécessaire. Une fois les injections terminées, retirez le chiot de la scène et marquez-le selon les procédures approuvées.

Une fois que le chiot s’est rétabli et qu’il est capable de se déplacer tout seul, remettez-le avec la femelle allaitante et le reste de la portée. Vérifiez les chiots après la procédure et le lendemain pour vous assurer qu’il n’y a aucun signe de détérioration de la santé.