Marquage d’interneurones remplis de biocytine dans des tranches d’hippocampe de rat pour visualisation

Prenez des tranches d’hippocampe de rat fixes et perméabilisées contenant des interneurones remplis de biocytine avec des peroxydases endogènes inactivées.

Ajoutez des complexes avidine-biotine (ABC) contenant de la peroxydase de raifort (HRP) et incubez, permettant à l’avidine de se lier à la biocytine.

Lavez l’ABC non lié.

Ajoutez un mélange de substrat chromogène et d’exhausteur de métal, puis incincubatez.

Introduisez du peroxyde d’hydrogène pour activer le HRP, qui oxyde le substrat pour former un précipité sombre, tandis que l’amplificateur améliore le contraste.

Transférez les tranches sur du papier filtre et retirez l’excédent de tampon. Traiter avec du tétroxyde d’osmium pour améliorer le contraste.

Placez les tranches sur une diapositive et montez-les. Déshydratez-les en augmentant les concentrations d’éthanol

Lavez les tranches dans de l’éthanol absolu et de l’oxyde de propylène.

Ajouter de la résine pour infiltrer les tissus.

Placez les tranches dans une planchette et chauffez pour polymériser la résine. Transférez les tranches sur une lame, placez une lamelle et solidifiez la résine.

À l’aide de la microscopie optique, visualisez les interneurones remplis de biocytine colorés de noir.

Placez les sections dans un flacon en verre propre contenant du PBS. Effectuez la réaction HRP avidine en incubant d’abord les sections dans le complexe biotine avidine, ou ABC, pendant au moins deux heures pour amplifier le produit de réaction HRP.

Ensuite, lavez les sections avec du PBS 3 fois pendant 10 minutes, puis avec un tampon Tris deux fois pendant 10 minutes. Après avoir retiré la dernière trace de lavage du tampon, ajoutez rapidement 1 goutte de solution de chlorure de nickel à 8 % à la solution de diaminobenzidine ou à la solution DAB. Ensuite, pipetez la solution pour la mélanger.

Et ajoutez rapidement 1 millilitre de cette solution sur les sections. Incuber les sections dans cette solution pendant 15 minutes. Ensuite, ajoutez 10 microlitres de peroxyde d’hydrogène à 1 % à la solution DAB. Laissez la réaction se dérouler dans l’obscurité sous une agitation constante pendant environ 1 à 2 minutes, jusqu’à ce que les cellules soient étiquetées.

Dans une hotte, placez un petit cercle de papier filtre dans une boîte de Pétri et humidifiez-la avec du PB. Soulevez les sections une par une de la fiole en verre à l’aide d’un pinceau et placez-les soigneusement à plat sur le papier. Couvrez les sections avec un autre cercle humide de papier filtre. Et retirez l’excès de tampon en touchant doucement le papier de soie à la surface.

Appliquez 8 ou 9 gouttes de tétroxyde d’osmium à 1 % dans du PB sur le papier supérieur. Couvrez le plat et conservez-le dans la hotte pendant au moins 30 minutes, mais pas plus d’une heure. Après avoir rincé, monté et recouvert les sections, déshydratez-les à travers une série de solutions alcooliques à 50 %, 70 %, 95 % et 100 %.

Après l’étape de déshydratation, transférez les sections dans un flacon en verre contenant 100 % d’éthanol sur un shaker pendant environ 5 minutes. Remplacez la solution alcoolisée par de l’oxyde de propylène et lavez trois fois pendant 5 minutes. Après le dernier lavage, conservez environ 2 millilitres d’oxyde de propylène dans le flacon et ajoutez de la résine dans un rapport de un pour un.

Assurez-vous que la résine est dissoute et maintenez les sections sous agitation constante pendant 30 minutes. Après 30 minutes, à l’aide d’un bâton en bois, placez chaque section dans une planchet en aluminium contenant de la résine époxy et incubez pendant la nuit. Le lendemain, placez la planchet sur une plaque chauffante pendant environ 10 minutes.

Ensuite, ramassez chaque section avec un bâton en bois et placez-la sur une diapositive propre. Une fois que toutes les sections ont été transférées sur la lame, visualisez la lame sous un microscope à dissection pour vérifier l’orientation des coupes et placez une lamelle sur les sections. Durcir au four pendant 48 heures à 56 degrés Celsius.