Évaluation de l’absorption du glucose dans les motoneurones des larves de drosophile avec un métabolisme du glucose régulé à la hausse

Placez les larves de drosophile témoin et mutante dans des plats séparés contenant un tampon sans glucose.

Disséquez les larves pour en retirer les organes internes, exposant ainsi le système nerveux central ou SNC.

Le SNC comprend un cordon nerveux ventral abritant des motoneurones. Chez les larves mutantes, ces neurones présentent un métabolisme du glucose régulé à la hausse.

Les motoneurones des deux groupes expriment des capteurs de glucose intracellulaires contenant des fluorophores donneurs et accepteurs.

Placez les larves sous un microscope confocal. Lors de l’excitation, le fluorophore donneur émet une fluorescence.

Localisez les motoneurones à l’aide de cette fluorescence.

Remplacez le tampon par une solution supplémentée en glucose.

Le glucose pénètre dans les neurones, se lie aux capteurs et déclenche un changement de conformation qui rapproche les deux fluorophores.

Lors de l’excitation, l’accepteur absorbe l’énergie émise par le donneur, appelée transfert d’énergie de résonance de fluorescence ou FRET, et émet de la fluorescence.

Le signal FRET est en corrélation avec l’absorption de glucose. Une intensité de signal d’accepteur plus élevée chez les larves mutantes par rapport au contrôle indique un métabolisme du glucose régulé à la hausse.

Avant de commencer les dissections, allumez le microscope d’imagerie et les lasers. Ensuite, récupérez une larve errante du troisième stade. Rincez-le à l’eau distillée deux fois et placez-le dans une goutte de tampon HL3 sur un plat préalablement préparé doublé d’élastomère.

Ensuite, à l’aide d’un microscope à dissection, utilisez une paire de pinces pour épingler les extrémités antérieure et postérieure de la larve, côté dorsal vers le haut, en étirant soigneusement la larve dans le sens de la longueur avec des épingles à insectes. À l’aide d’une paire de ciseaux à iris inclinés, faites une incision juste au-dessus de la goupille postérieure. Faites ensuite une coupe verticale de l’incision vers l’extrémité antérieure de la larve.

Après avoir ajouté quelques gouttes de tampon HL3, si nécessaire, retirez la trachée et le reste des organes flottants sans perturber le système nerveux central. Ensuite, épinglez les rabats, étirant la paroi corporelle, pour exposer le système nerveux central tout en gardant le système neuromusculaire intact.

Pour l’acquisition d’images, utilisez un microscope confocal droit avec une lentille d’immersion dans l’eau 40x. Ensuite, sélectionnez le laser de 405 nanomètres pour exciter le CFP. Ensuite, optimisez les paramètres d’acquisition, tels que la vitesse de numérisation, la moyenne, l’objectif, la taille du sténopé de zoom et la résolution spatiale. Ajustez le gain de manière à ce que le signal se trouve dans la plage dynamique optimale et utilisez les mêmes paramètres pour tous les génotypes.

Pour imager les motoneurones à l’intérieur du cordon nerveux ventral, placez la boîte en silicone avec l’échantillon disséqué sous le cristallin et abaissez le cristallin de manière à ce qu’il entre en contact avec le saccharose tréhalose HL3. Assurez-vous que l’objectif est complètement immergé dans le tampon et ajoutez-en plus si nécessaire.

Ensuite, à l’aide des canaux CFP et FRET, sélectionnez manuellement une sélection optique composée d’au moins 6 motoneurones au foyer, situés le long de la ligne médiane du cordon nerveux ventral. Ensuite, acquérez des images toutes les 10 secondes ou 10 minutes. Ces images représentent la ligne de base.

Pour la stimulation du glucose, prélever le tampon HL3 contenant du saccharose de tréhalose à l’aide d’une pipette Pasteur et ajouter 5 millimolaires de tampon HL3 complété par du glucose sans déplacer le cordon nerveux ventral. Ensuite, acquérez des images toutes les 10 secondes pendant 10 minutes supplémentaires.

Ces images représentent la phase de stimulation. Enregistrez les images sous forme de fichiers point czi ou de tout type de fichier pris en charge par le logiciel d’imagerie avec un nom de fichier comprenant la date, le fond génétique, l’état expérimental et les canaux utilisés. Réutilisation des paramètres pour imager tous les génotypes.