Imagerie de cellules vivantes de la Et Streptococcus pneumoniae À l'aide automatisée de microscopie time-lapse

L’objectif global de cette procédure est d’imager des cellules vivantes à travers la croissance et la division à l’aide de la microscopie à fluorescence afin d’étudier l’effet de l’histoire cellulaire et de l’ascendance sur le développement cellulaire des bactéries. Ceci est accompli en transférant d’abord les cellules d’un milieu liquide avec des concentrations de nutriments relativement élevées vers un milieu de famine liquide. Ensuite, une lame microscopique sur laquelle les cellules bactériennes se développeront en une micro-colonie.

La monocouche est préparée. Ensuite, un film de microscopie à fluorescence en accéléré est enregistré. Enfin, le film est traité et les données sont analysées.

En fin de compte, on peut obtenir des résultats qui montrent le développement d’une seule cellule bactérienne par microscopie à fluorescence time-lapse. Le principal avantage de cette technique par rapport aux techniques existantes telles que la cytométrie en flux et la microscopie standard, est qu’elle permet de surveiller la dynamique des protéines, le comportement cellulaire et le développement de cellules uniques dans le temps, démontrant que la procédure sera en cône, un doctorant de mon laboratoire Pour préparer des cellules inoculées à partir de moins 80 degrés Celsius, stocks dans 10 millilitres de microscopie time-lapse ou de milieu TLM dans des flacons agités stériles complétés par des antibiotiques si nécessaire, faire pousser les cellules pendant la nuit à 30 degrés Celsius et 225 tr/min dans un ballon agité stérile le lendemain matin pour piller les cellules d’un à 10 dans un milieu préchauffé, chimiquement défini ou CDM sans antibiotiques, faire pousser les cellules les plus subtiles de l’abeille jusqu’au milieu de la phase exponentielle, ce qui prend environ quatre heures. Mesurer l’absorbance de la culture à 600 nanomètres et diluer les cellules à environ 600 de 0,035.

Utilisation du CDM. Ce DO garantit que les cellules uniques avec un espacement approprié entre les cellules sont repérées sur la lame du microscope pour la microscopie time-lapse. Une heure avant que les cellules n’atteignent une croissance exponentielle moyenne.

Préparez la lame de microscope en nettoyant deux lames de verre avec de l’éthanol à 70 % et de l’eau. Retirez l’un des couvercles en plastique d’un cadre génétique, en faisant attention de ne pas provoquer le démontage du couvercle en plastique de l’autre côté du cadre. Fixez le cadre du gène au milieu de l’une des lames de verre en le collant d’abord d’un côté, puis en guidant le reste avec un ongle.

Utilisez un micro-ondes pour dissoudre 150 milligrammes d’aros haute résolution à faible point de fusion. Dans 10 millilitres de CDM, assurez-vous que l’aros est complètement dissous pour éviter la fluorescence de fond. Pipetez 500 microlitres de l’agro CDM chaud au milieu du cadre génétique, en vous assurant que toute la zone, y compris les bords, est entièrement couverte.

Travailler rapidement pour éviter un dessèchement excessif des aros. Placez la deuxième lame de verre sur le cadre de gènes rempli d’Aros CDM en essayant d’éviter les bulles d’air. Placez le sandwich en position horizontale à quatre degrés Celsius pendant 45 minutes pour permettre aux agros de se solidifier suffisamment.

Une fois que l’aros s’est solidifié soigneusement, faites glisser la vitre supérieure. À l’aide d’une lame de rasoir, découpez des bandes agro d’environ cinq millimètres de largeur sur lesquelles les bactéries se développeront. Un maximum de trois bandes peut être utilisé par lame, séparées par des espaces d’environ quatre millimètres de chaque côté.

Ces espaces fourniront de l’air, ce qui est essentiel à la croissance de Blu. Retirez soigneusement le deuxième et dernier couvercle en plastique du cadre génétique pour exposer le côté collant. Chargez des cellules individuelles dans environ 2,5 microlitres de liquide sur le milieu solide, en commençant par le haut du tampon agricole sans le toucher.

Avec la pointe de la pipette, laissez le fluide s’étaler uniformément en inclinant la lame de haut en bas. Placez un couvercle de microscope propre sur le cadre du gène pour fixer complètement la lamelle. Utilisez un ongle pour appliquer une pression Donc, après que les cellules aient été chargées.

Il est crucial d’attendre que le liquide sèche suffisamment longtemps pour éviter d’avoir des cellules nageuses et une croissance en plusieurs couches. Cependant, si les cellules sont séchées trop longtemps, elles auront des problèmes pour se transformer en une monocouche de micro-cholon. Ainsi, le temps nécessaire au séchage de vos lames dépend de l’expérience et ne peut pas être mesuré.

Et par conséquent, il faut bien sûr s’y habituer Pour éviter les problèmes de mise au point automatique pendant les premières heures de l’expérience time-lapse, préchauffez la lame pendant une heure à 30 degrés Celsius pour vous préparer à la microscopie time-lapse. Préchauffez la chambre environnementale au moins deux heures. Avant le début de l’expérience, sélectionnez les filtres d’objectif et le miroir dichroïque appropriés en fonction de votre configuration expérimentale.

Pour les expériences longues, assurez-vous qu’un filtre UV est placé entre la source lumineuse et l’échantillon. De plus, si possible, bloquez une partie de la lumière d’excitation à l’aide de filtres à densité neutre pour minimiser l’exposition. Programmez l’expérience en fonction de la configuration expérimentale spécifique.

Il est sage de déterminer la quantité de lumière nécessaire pour des constructions spécifiques ainsi que les paramètres de mise au point automatique pour d’autres microscopes à intervalle de temps ou bactéries avant l’expérience proprement dite. Des temps d’exposition plus courts et des niveaux de lumière d’excitation plus faibles minimiseront le blanchiment et la phototoxicité Utilisez une lumière scopique pour la fonction de mise au point automatique. Enfin, placez la lame préparée dans la chambre environnementale préchauffée du microscope et surveillez la croissance des cellules uniques en une monocouche de microcolonie à 30 degrés Celsius.

Une expérience de fluorescence en accéléré réussie produira une monocouche de microcolonie entièrement située dans le champ de vision. À la fin de l’expérience de ce film, le champ clair est à gauche et la fluorescence est visible. Sur la droite.

Voici un exemple de micro-colonie B Subtles dans laquelle certaines cellules se sont développées les unes sur les autres, ce qui rend difficile de retracer leur histoire avec précision et de mesurer correctement leurs niveaux de fluorescence. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de préparer avec succès un échantillon microscopique pour la microscopie à intervalle de temps et de la façon d’effectuer une microscopie à fluorescence à intervalle. Expérimentez avec des cellules BACE.