Name: Imagerie de cellules vivantes de la Et Streptococcus pneumoniae À laide automatisée de microscopie time-lapse (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 31 s
Description: Découvrez la microscopie en fluorescence time-lapse automatisée pour observer le comportement cellulaire de Bacillus subtilis et Streptococcus pneumoniae. Cette méthode permet d'étudier la dynamique des protéines et le développement des cellules individuelles en temps réel.

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<li>Guberman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PSICIC%3A+noise+and+asymmetry+in+bacterial+division+revealed+by+computational+image+analysis+at+sub-pixel+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS.+Comput.+Biol%22%5BJournal%5D)">PSICIC: noise and asymmetry in bacterial division revealed by computational image analysis at sub-pixel resolution.</a> PLoS. Comput. Biol. 4 (11), 1000233-1000233 (2008).</li>
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<li>Avery, O. T., Macleod, C. M., McCarty, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+the+chemical+nature+of+the+substance+inducing+transformation+of+pneumococcal+types%3A+Induction+of+transformation+by+a+desoxyribonucleic+acid+fraction+isolated+from+pneumococcus+type+III%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Studies on the chemical nature of the substance inducing transformation of pneumococcal types: Induction of transformation by a desoxyribonucleic acid fraction isolated from pneumococcus type III.</a> J Exp. Med. 79, 137-137 (1944).</li>
<li>Hoskins, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+of+the+bacterium+Streptococcus+pneumoniae+strain+R6%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Genome of the bacterium Streptococcus pneumoniae strain R6.</a> J Bacteriol. 183, 5709-5709 (2001).</li>
<li>Martin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+recA+gene+of+Streptococcus+pneumoniae+is+part+of+a+competence-induced+operon+and+controls+lysogenic+induction%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The recA gene of Streptococcus pneumoniae is part of a competence-induced operon and controls lysogenic induction.</a> Mol Microbiol. 15, 367-367 (1995).</li>
</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Contrairement à beaucoup d&#39;autres techniques de cellule unique, la méthode time-lapse de microscopie par fluorescence décrites ici peuvent être utilisés pour suivre l&#39;histoire d&#39;une cellule spécifique à l&#39;égard de ses ancêtres, son comportement, et les événements de division. En combinaison avec des promoteurs cibles marquées par fluorescence ou de protéines, spécifiques activation de la voie de développement peuvent être suivies dans le temps et la localisation des protéines ainsi que la dynamique des protéines peuvent être surveillés pendant le développement bactérien. Comme indiqué plus haut, les études se concentrant sur différentes espèces bactériennes peuvent être réalisées en adaptant les conditions de croissance selon les exigences pour une bactérie spécifique. Les seules limites que nous avons rencontrées sont liées aux conditions de croissance et taille de l&#39;échantillon. En raison d&#39;un environnement hermétique, des conditions de milieu ne peut pas être changé pendant l&#39;expérience. Par ailleurs, un maximum de quatre souches par expérience peut être contrôlé efficacement. Considérant quelques critiques, la méthode seule cellule d&#39;analyse décrites ici peuvent facilement être appliqués en utilisant un microscope automatisé. Dans la suite, un aperçu de ces étapes critiques sera donnée. Des informations détaillées peuvent être trouvées dans le texte principal la préparation générale:. Il est sage de vérifier les réglages autofocus requis pour une bactérie spécifique avant l&#39;expérience. De même, environ paramètres optimaux pour la visualisation de la fluorescence devrait être déterminé à l&#39;avance, si possible. Par ailleurs, suite à un prêt de temps en ligne permet d&#39;avoir tout le matériel prêt à l&#39;emploi dans le temps (pré-réchauffement de la chambre du microscope, la programmation des réglages du microscope, la préparation de la lame, une heure avant les cellules sont en phase de croissance désiré, voir figure 1) . Croissance de B. subtilis dans le TLM et MDP: TLM et le MDP sont chimiquement défini les médias dans lesquels la famine B. subtilis ne pousse que lentement. La période de temps dans lequel les cellules sont cultivées dans les médias pourrait être prolongée en fonction de la souche spécifique. La croissance lente empêche les cellules de s&#39;accumuler sur l&#39;autre Préparation de l&#39;échantillon de microscope:. Bulles d&#39;air entre le cadre de gènes, la lame de verre et de la lamelle doit être empêché pour éviter le dessèchement vaste du milieu à base d&#39;agarose. La même chose vaut pour l&#39;interface de glissement moyen / couverture. Il est crucial de laisser les cellules assez sec, pour éviter la baignade et / ou de croissance de couches multiples Time-lapse de microscopie par fluorescence:. Pré-réchauffement de la lame ainsi que la chambre de l&#39;environnement est essentielle pour prévenir les problèmes majeurs autofocus. Les cellules doivent être choisis au milieu d&#39;un tampon d&#39;agar, puisque ceux-ci ont le plus de chance de rester dans le champ et de se concentrer pendant l&#39;expérience (fourni l&#39;échantillon a été séché assez bien). Un maximum de 10 emplacements par des expériences fonctionne toujours correctement. Après avoir sélectionné la première cellule d&#39;intérêt à utiliser le logiciel pour ajuster la mise au point (voir texte pour plus de détails). Vérifiez si les cellules sont encore en mise au point pendant les premières heures de l&#39;expérience dans des intervalles de 30 min. Analyse: Il est important de vérifier avant de procédures d&#39;analyse étendue si le contexte du milieu a les mêmes valeurs dans les canaux de fluorescence. Petites particules de poussière, les composantes moyennes, les verres sales ou minuscules touffes d&#39;agarose peuvent contribuer à la fluorescence localement accrue, ce qui rend le film difficile, voire impossible d&#39;analyser Dépannage:. Si les cellules se développent au-dessus de l&#39;autre, cela pourrait indiquer soit la lamelle a été attachée trop tôt ou que le support n&#39;est pas adapté à la croissance de monocouches microcolonie. Si les cellules d&#39;intérêt sans cesse mourir prématurément, tandis que d&#39;autres cellules sur la lame divisent heureusement, vous pouvez vérifier si vous mettez le filtre UV en position. Il pourrait également aider à diminuer le temps d&#39;exposition ou l&#39;intensité lumineuse au cours des expériences de long.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du réactif </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commentaires (optionnel) </th></tr><tr><td> Gene Cadre </td><td> ABgene </td><td> AB-0578 </td><td> 1,7 x 2,8 cm </td></tr><tr><td> haute résolution basse température de fusion d&#39;agarose </td><td> Sigma </td><td> A4718 </td><td></td></tr><tr><td> lamelle grands </td><td> plusieurs </td><td></td><td> 24 x 50 mm </td></tr><tr><td> si désiré, une membrane de teinture, par exemple FM 5-95 </td><td> Invitrogen </td><td> T23360 </td><td> colorants autre membrane sont également disponibles: <a href="http://probes.invitrogen.com/media/pis/mp34653.pdf">http://probes.invitrogen.com/media/pis/mp34653.pdf</a> </td></tr><tr><td> Time-lapse microscope avec chambre environnementale </td><td> plusieurs </td><td></td><td> voir les détails de notre dispositif dans les sections correspondantes </td></tr></tbody></table>

imagerie de cellules vivantes de la<embacillus subtilis> et streptococcus pneumoniae À l&#39;aide automatisée de microscopie time-lapse

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

Durant les dernières années les scientifiques de plus en plus conscients que la moyenne des données obtenues par des expériences de la population microbienne base ne sont pas représentatifs du comportement, le statut ou le phénotype des cellules individuelles. Grâce à cette nouvelle perspective le nombre d&#39;études seule cellule augmente continuellement (pour des revues récentes, voir 1,2,3). Cependant, la plupart des techniques cellule unique appliquée ne permettent pas de suivre l&#39;évolution et le comportement d&#39;une seule cellule spécifique dans le temps (par exemple, la cytométrie en flux ou la microscopie standard). Ici, nous fournir une description détaillée d&#39;une méthode de microscopie utilisée dans plusieurs études récentes 4, 5, 6, 7, ce qui permet de suivre et d&#39;enregistrer (de fluorescence des) personne cellules bactériennes de Bacillus subtilis et Streptococcus pneumoniae par la croissance et la division pour de nombreuses générations. Les films qui en résulte peut être utilisé pour construire des arbres phylogénétiques lignée en remontant l&#39;histoire d&#39;une cellule unique dans une population qui provenaient d&#39;un ancêtre commun. Cette méthode time-lapse de fluorescence microscopie peut être utilisé non seulement pour enquêter sur la croissance, la division et la différenciation des cellules individuelles, mais aussi d&#39;analyser l&#39;effet de l&#39;histoire de la cellule et l&#39;ascendance sur le comportement cellulaire spécifique. Par ailleurs, la microscopie time-lapse est idéalement adapté à examiner la dynamique de l&#39;expression génique et la localisation des protéines au cours du cycle cellulaire de la bactérie. La méthode explique comment préparer les cellules bactériennes et de construire la lame du microscope pour permettre à l&#39;excroissance de cellules individuelles dans une microcolonie. En bref, des cellules individuelles sont repérés sur une surface semi-solide composé d&#39;un milieu de croissance complétées par d&#39;agarose sur lequel ils croissent et se divisent sous un microscope à fluorescence dans un environnement contrôlé température de la chambre. Les images sont capturées à des intervalles spécifiques et sont ensuite analysés en utilisant le logiciel open source ImageJ.

Ce protocole prévoit une procédure étape par étape pour surveiller le comportement seule cellule de bactéries différentes dans le temps en utilisant la fluorescence automatisée de microscopie time-lapse. En outre, nous fournir des lignes directrices comment analyser les images de microscopie.

Imagerie de cellules vivantes de la<emBacillus subtilis> Et Streptococcus pneumoniae À l&#39;aide automatisée de microscopie time-lapse

Au cours des dernières années, les scientifiques ont pris conscience de manière croissante que les données moyennes obtenues à partir d'expériences basées sur des populations microbiennes ne sont pas...

L'objectif général de cette procédure est d'observer des cellules vivantes au cours de leur croissance et de leur division à l'aide de la microscopie à fluorescence, afin d'étudier l'effet de l'historique cellulaire et de l'ascendance sur le développement cellulaire des bactéries. Cela est réalisé en transférant d'abord les cellules depuis un milieu liquide à concentration relativement élevée en nutriments vers un milieu liquide de privation. Ensuite, une lame de microscope sur laquelle les cellules bactériennes vont croître pour former une micro-colonie.Un monocouche est préparée. Ensuite, un film en microscopie à fluorescence en lapse de temps est enregistré. Enfin, le film est traité et les données sont analysées.En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus qui montrent le développement d'une cellule bactérienne unique au fil du temps par microscopie de fluorescence en lapse de temps. Le principal avantage de cette technique par rapport aux techniques existantes telles que la cytométrie en flux et la microscopie standard est qu'elle permet de surveiller la dynamique des protéines, le comportement cellulaire et le développement de cellules individuelles dans le temps, démontrant ainsi la procédure qui sera réalisée par Cone, une étudiante au doctorat de mon laboratoire. Pour préparer les cellules de *B. subtilis*, inoculer les cellules provenant de stocks conservés à −80 °C dans 10 millilitres de milieu pour microscopie en lapse de temps (TLM) dans des flacons stériles sous agitation, supplémenté d'antibiotiques si nécessaire, puis faire croître les cellules pendant la nuit à 30 °C et 225 tr/min dans un flacon stérile. Le lendemain matin, récupérer les cellules et les diluer de 1 à 10 dans un milieu chimiquement défini (CDM) préchauffé, sans antibiotiques. Faire croître les cellules de *B. subtilis* jusqu'à la phase exponentielle moyenne, ce qui prend environ quatre heures. Mesurer l'absorbance de la culture à 600 nanomètres et diluer les cellules pour obtenir une absorbance approximative à 600 de 0,035.En utilisant le milieu CDM. Cette DO garantit que des cellules individuelles, convenablement espacées les unes des autres, sont déposées sur la lame de microscope pour la microscopie en temps réel. Une heure avant que les cellules n'atteignent la phase de croissance exponentielle moyenne.Préparer la lame de microscope en nettoyant deux lames en verre avec de l'éthanol à 70 % et de l'eau. Retirer l'un des couvercles en plastique d'un cadre à gène, en prenant soin de ne pas provoquer le démontage du couvercle en plastique de l'autre côté du cadre. Fixer le cadre à gène au milieu de l'une des lames en verre en commençant par l'appliquer sur un côté, puis en guidant le reste avec l'ongle.Utilisez un micro-ondes pour dissoudre 150 milligrammes d'agarose à haute résolution et à bas point de fusion dans 10 millilitres de CDM. Assurez-vous que l'agarose est complètement dissoute afin d'éviter une fluorescence de fond. Pipetez 500 microlitres du CDM agros tiède au centre du cadre génétique, en veillant à ce que toute la surface, y compris les bords, soit entièrement recouverte.Travailler rapidement pour éviter un dessèchement excessif des aros. Placer la deuxième lame de verre sur le cadre de gène Aros CDM rempli en essayant d'éviter les bulles d'air. Placer l'assemblage en position horizontale à quatre degrés Celsius pendant 45 minutes afin de permettre aux agros de se solidifier suffisamment.Une fois que l'agarose est solidifiée avec soin, faites glisser le verre supérieur. Utilisez une lame de rasoir pour découper des bandes d'agarose d'environ cinq millimètres de largeur sur lesquelles les bactéries vont croître. Un maximum de trois bandes peut être utilisé par lame, séparées par des espaces d'environ quatre millimètres de chaque côté.Ces espaces fourniront de l'air, essentiel à la croissance de Blu. Retirez soigneusement la deuxième et dernière couverture en plastique du cadre génétique afin d'exposer le côté adhésif. Déposez des cellules individuelles dans environ 2,5 microlitres de liquide sur le milieu solide, en commençant par le haut du tampon agros sans le toucher.Avec la pointe de pipette, incliner la lame vers le haut et vers le bas pour permettre au milieu de se répartir uniformément. Placer une lame de couverture microscopique propre sur le cadre génétique afin d'appliquer complètement la lamelle. Utiliser l'ongle pour appliquer une pression une fois que les cellules ont été chargées.Il est essentiel d'attendre suffisamment longtemps que le liquide sèche afin d'éviter d'obtenir des cellules nageant librement et une croissance en plusieurs couches. Toutefois, si les cellules sont trop longtemps séchées, elles auront des difficultés à former une monocouche de micro-colonies. Ainsi, le temps nécessaire pour sécher vos lames dépend de l'expérience et ne peut pas être mesuré précisément.Et par conséquent, il faut bien sûr s'y habituer. Pour éviter les problèmes de mise au point automatique pendant les premières heures de l'expérience en microscopie temporelle, préchauffez la lame pendant une heure à 30 degrés Celsius avant de commencer. Préchauffez la chambre environnementale au moins deux heures à l'avance. Avant le début de l'expérience, sélectionnez l'objectif, les filtres et le miroir dichroïque appropriés en fonction de votre dispositif expérimental.Pour les expériences de longue durée, veillez à placer un filtre UV entre la source lumineuse et l'échantillon. En outre, si possible, bloquez une partie de la lumière d'excitation à l'aide de filtres de densité neutre afin de minimiser l'exposition. Programmez l'expérience en fonction du dispositif expérimental spécifique.Il est conseillé de déterminer la quantité de lumière requise pour des constructions spécifiques ainsi que les réglages de mise au point automatique pour d'autres microscopes à laps de temps ou bactéries avant l'expérience proprement dite. Des temps d'exposition plus courts et des niveaux de lumière d'excitation plus faibles minimiseront le photoblanchiment et la phototoxicité. Utilisez une lumière scotopique pour la fonction de mise au point automatique. Enfin, placez la lame préparée dans la chambre environnementale préchauffée du microscope et surveillez la croissance de cellules individuelles en une monocouche de microcolonies à 30 degrés Celsius.Une expérience de fluorescence en lapse de temps réussie produira une monocouche de microcolonie située entièrement dans le champ de vision. À la fin de l'expérience dans ce film, le champ clair se trouve à gauche et la fluorescence est visible à droite.Voici un exemple de microcolony de B Subtles dans laquelle certaines cellules ont poussé les unes sur les autres, rendant difficile le traçage précis de leur historique ainsi que la mesure correcte de leurs niveaux de fluorescence. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment préparer avec succès un échantillon microscopique pour la microscopie en time-lapse et comment réaliser une microscopie de fluorescence en time-lapse. Expérimentez avec des cellules BACE.

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