Imagerie de cellules vivantes de la Et Streptococcus pneumoniae À l'aide automatisée de microscopie time-lapse

L'objectif général de cette procédure est d'observer des cellules vivantes au cours de leur croissance et de leur division à l'aide de la microscopie à fluorescence, afin d'étudier l'effet de l'historique cellulaire et de l'ascendance sur le développement cellulaire des bactéries. Cela est réalisé en transférant d'abord les cellules depuis un milieu liquide à concentration relativement élevée en nutriments vers un milieu liquide de privation. Ensuite, une lame de microscope sur laquelle les cellules bactériennes vont croître pour former une micro-colonie.

Un monocouche est préparée. Ensuite, un film en microscopie à fluorescence en lapse de temps est enregistré. Enfin, le film est traité et les données sont analysées.

En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus qui montrent le développement d'une cellule bactérienne unique au fil du temps par microscopie de fluorescence en lapse de temps. Le principal avantage de cette technique par rapport aux techniques existantes telles que la cytométrie en flux et la microscopie standard est qu'elle permet de surveiller la dynamique des protéines, le comportement cellulaire et le développement de cellules individuelles dans le temps, démontrant ainsi la procédure qui sera réalisée par Cone, une étudiante au doctorat de mon laboratoire. Pour préparer les cellules de *B. subtilis*, inoculer les cellules provenant de stocks conservés à −80 °C dans 10 millilitres de milieu pour microscopie en lapse de temps (TLM) dans des flacons stériles sous agitation, supplémenté d'antibiotiques si nécessaire, puis faire croître les cellules pendant la nuit à 30 °C et 225 tr/min dans un flacon stérile. Le lendemain matin, récupérer les cellules et les diluer de 1 à 10 dans un milieu chimiquement défini (CDM) préchauffé, sans antibiotiques. Faire croître les cellules de *B. subtilis* jusqu'à la phase exponentielle moyenne, ce qui prend environ quatre heures. Mesurer l'absorbance de la culture à 600 nanomètres et diluer les cellules pour obtenir une absorbance approximative à 600 de 0,035.

En utilisant le milieu CDM. Cette DO garantit que des cellules individuelles, convenablement espacées les unes des autres, sont déposées sur la lame de microscope pour la microscopie en temps réel. Une heure avant que les cellules n'atteignent la phase de croissance exponentielle moyenne.

Préparer la lame de microscope en nettoyant deux lames en verre avec de l'éthanol à 70 % et de l'eau. Retirer l'un des couvercles en plastique d'un cadre à gène, en prenant soin de ne pas provoquer le démontage du couvercle en plastique de l'autre côté du cadre. Fixer le cadre à gène au milieu de l'une des lames en verre en commençant par l'appliquer sur un côté, puis en guidant le reste avec l'ongle.

Utilisez un micro-ondes pour dissoudre 150 milligrammes d'agarose à haute résolution et à bas point de fusion dans 10 millilitres de CDM. Assurez-vous que l'agarose est complètement dissoute afin d'éviter une fluorescence de fond. Pipetez 500 microlitres du CDM agros tiède au centre du cadre génétique, en veillant à ce que toute la surface, y compris les bords, soit entièrement recouverte.

Travailler rapidement pour éviter un dessèchement excessif des aros. Placer la deuxième lame de verre sur le cadre de gène Aros CDM rempli en essayant d'éviter les bulles d'air. Placer l'assemblage en position horizontale à quatre degrés Celsius pendant 45 minutes afin de permettre aux agros de se solidifier suffisamment.

Une fois que l'agarose est solidifiée avec soin, faites glisser le verre supérieur. Utilisez une lame de rasoir pour découper des bandes d'agarose d'environ cinq millimètres de largeur sur lesquelles les bactéries vont croître. Un maximum de trois bandes peut être utilisé par lame, séparées par des espaces d'environ quatre millimètres de chaque côté.

Ces espaces fourniront de l'air, essentiel à la croissance de Blu. Retirez soigneusement la deuxième et dernière couverture en plastique du cadre génétique afin d'exposer le côté adhésif. Déposez des cellules individuelles dans environ 2,5 microlitres de liquide sur le milieu solide, en commençant par le haut du tampon agros sans le toucher.

Avec la pointe de pipette, incliner la lame vers le haut et vers le bas pour permettre au milieu de se répartir uniformément. Placer une lame de couverture microscopique propre sur le cadre génétique afin d'appliquer complètement la lamelle. Utiliser l'ongle pour appliquer une pression une fois que les cellules ont été chargées.

Il est essentiel d'attendre suffisamment longtemps que le liquide sèche afin d'éviter d'obtenir des cellules nageant librement et une croissance en plusieurs couches. Toutefois, si les cellules sont trop longtemps séchées, elles auront des difficultés à former une monocouche de micro-colonies. Ainsi, le temps nécessaire pour sécher vos lames dépend de l'expérience et ne peut pas être mesuré précisément.

Et par conséquent, il faut bien sûr s'y habituer. Pour éviter les problèmes de mise au point automatique pendant les premières heures de l'expérience en microscopie temporelle, préchauffez la lame pendant une heure à 30 degrés Celsius avant de commencer. Préchauffez la chambre environnementale au moins deux heures à l'avance. Avant le début de l'expérience, sélectionnez l'objectif, les filtres et le miroir dichroïque appropriés en fonction de votre dispositif expérimental.

Pour les expériences de longue durée, veillez à placer un filtre UV entre la source lumineuse et l'échantillon. En outre, si possible, bloquez une partie de la lumière d'excitation à l'aide de filtres de densité neutre afin de minimiser l'exposition. Programmez l'expérience en fonction du dispositif expérimental spécifique.

Il est conseillé de déterminer la quantité de lumière requise pour des constructions spécifiques ainsi que les réglages de mise au point automatique pour d'autres microscopes à laps de temps ou bactéries avant l'expérience proprement dite. Des temps d'exposition plus courts et des niveaux de lumière d'excitation plus faibles minimiseront le photoblanchiment et la phototoxicité. Utilisez une lumière scotopique pour la fonction de mise au point automatique. Enfin, placez la lame préparée dans la chambre environnementale préchauffée du microscope et surveillez la croissance de cellules individuelles en une monocouche de microcolonies à 30 degrés Celsius.

Une expérience de fluorescence en lapse de temps réussie produira une monocouche de microcolonie située entièrement dans le champ de vision. À la fin de l'expérience dans ce film, le champ clair se trouve à gauche et la fluorescence est visible à droite.

Voici un exemple de microcolony de B Subtles dans laquelle certaines cellules ont poussé les unes sur les autres, rendant difficile le traçage précis de leur historique ainsi que la mesure correcte de leurs niveaux de fluorescence. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment préparer avec succès un échantillon microscopique pour la microscopie en time-lapse et comment réaliser une microscopie de fluorescence en time-lapse. Expérimentez avec des cellules BACE.