Séparation de l'ADN simple brin, double brin de l'ADN et l'ARN à partir d'un environnement communautaire viral en utilisant chromatographie d'hydroxyapatite

Cette vidéo montre une procédure de séparation d’assemblages viraux mixtes en fonction de leur composition en acides nucléiques. Cela permet d’étudier la diversité taxonomique et le potentiel fonctionnel d’assemblages viraux complexes. Ici, l’hydroxyapatite, une forme cristalline de phosphate de calcium, est utilisée dans la séparation des acides nucléiques.

Tout d’abord, une colonne d’hydroxyapatite est emballée et des acides nucléiques viraux purifiés équilibrés sont ensuite appliqués à la colonne, l’interaction de charge entre les ions calcium chargés positivement de l’hydroxyapatite et le squelette phosphate chargé négativement des sous-types d’acides nucléiques lie les acides nucléiques à la colonne Nick. Ensuite, l’ADN simple brin, D-N-A-R-N-A et double brin sont séquentiellement associés à différentes concentrations de tampon phosphate. Les acides nucléiques résultants sont ensuite dessalés et concentrés en préparation de la visualisation, de la quantification et de l’identification par séquençage de l’ADN. L’électrophorèse sur agro-gel confirme que les espèces d’acides nucléiques peuvent être séparées avec moins de 9 % de rémanence.

Ainsi, cette méthode permet d’évaluer la diversité et la capacité fonctionnelle des communautés virales. Bonjour, je m’appelle Doug Fro, et je suis associé de recherche dans le laboratoire du Dr Shannon Williamson au j Craig Venture Institute. Aujourd’hui, je vais vous montrer une procédure pour séparer l’ADN simple brin, l’ADN double brin et l’ARN d’un assemblage viral environnemental.

Cette méthode présente des avantages par rapport aux méthodes existantes telles que le traitement avec le noyau, qui cible soit l’ADN, soit l’ARN. La chromatographie à l’hydroxyapatite a la capacité de capturer l’ensemble de la communauté virale. Cette méthode nous permet de répondre à plusieurs questions dans le domaine de l’écologie virale.

Par exemple, quel est le complément génétique total ou la diversité de la communauté virale ? Nous avons d’abord pensé à cette méthode lorsque nous avons voulu étudier l’ensemble des assemblages de plancton du Rio de la baie de Chesapeake sans sacrifier un sous-ensemble de la signature génétique. Les solutions nécessaires à cette expérience doivent être préparées à l’avance conformément aux instructions du protocole écrit qui l’accompagne, et comprennent un tampon de phosphate de 0,12 molaire, un tampon de phosphate de 0,20 molaire, un tampon de phosphate de 0,40 molaire et une solution de phosphate molaire.

Tous à pH 6,8 et de l’hydroxyapatite hydratée le jour de l’expérience, équilibrez tous les tampons de phosphate et l’hydroxyapatite hydratée en les plaçant dans un bain d’eau à 60 degrés Celsius. Commencez cette procédure en préparant la colonne econo qui sera utilisée pour la séparation des acides nucléiques viraux. Fixez un robinet d’arrêt à l’extrémité de la colonne écono et assurez-vous qu’elle est fermée.

À l’aide d’une pipette, ajoutez de l’eau déminéralisée dans la colonne, puis placez le capuchon sur le dessus de la colonne et retournez la colonne à plusieurs reprises pour la rincer. Videz l’eau et répétez ce lavage plusieurs fois. Ensuite, retirez le robinet d’arrêt de la colonne économique et autoclavez-le pour le stériliser.

Le robinet d’arrêt n’est pas autoclave car il fondra. Rincez le robinet d’arrêt avec de l’eau ionisée, puis à nouveau avec de l’éthanol à 70 % et laissez-le sécher à l’air libre après l’autoclavage. Replacez le robinet d’arrêt et fermez-le.

Ensuite, en travaillant dans une hotte, ajoutez un millilitre de couche sigma à la colonne et enduisez le verre de la colonne en inversant la colonne avec un mouvement de roulement comme illustré ici. Le revêtement avec une couche sigma minimisera l’adhérence des acides nucléiques à la surface du verre. Lors de la séparation, un surface en verre de sel a été enduite.

Ouvrez le robinet d’arrêt et décantez dans un tube conique. Ensuite, pour connecter la colonne à un bain-marie en circulation, utilisez deux pinces pour fixer la colonne à un support annulaire. Fixez le tube en silicone du bain-marie en circulation, de sorte que le débit de l’eau du bain-marie se fasse de bas en haut.

Réglez la température à 60 degrés Celsius et démarrez la circulation. Alors qu’en pratique, la colonne et le tube seraient enveloppés dans un agent isolant, tel qu’une feuille d’aluminium ou un isolant de tuyau en mousse. Pour minimiser les pertes de chaleur, cette étape n’est pas illustrée ici.

Afin de mieux visualiser la procédure, fermez le robinet d’arrêt. À l’aide d’une pipette, ajoutez 10 millilitres d’eau stérile sans ARN. Ouvrez le robinet d’arrêt et laissez l’eau s’écouler.

Puis laver à nouveau après le deuxième lavage. Rincer deux fois avec 10 millilitres d’ARN stériles, sans tampon de phosphate 0,12 molaire, et décanter entre les lavages. La colonne est maintenant prête pour la chromatographie à l’hydroxyapatite.

Assurez-vous que le robinet d’arrêt de la colonne econ est fermé. Ensuite, à l’aide d’une pipette sérologique stérile de deux millilitres, ajoutez lentement deux millilitres d’appétit hydroxy réhydraté préparé et remis en suspension au fond de la colonne. Replacez le capuchon de colonne.

Laissez l’appétit hydroxylé se stabiliser sous la force de gravité pendant 30 minutes. Cette méthode nécessite une attention particulière aux détails. La colonne hydroxy-appétit se traite à un rythme de 0,25 à 0,5 mils par minute.

Il est donc très important de garder un œil attentif sur la colonne afin qu’elle ne se dessèche pas. Après 30 minutes, ouvrez le robinet d’arrêt pour vider le tampon dans un conteneur à déchets. Fermez le robinet d’arrêt et jetez le flux.

Combinez les acides nucléiques avec un tampon de phosphate de 0,12 molaire dans un volume final de 500 microlitres et incubez-le à 60 degrés Celsius pendant 10 minutes. Cela équilibrera les acides nucléiques à la température de la colonne et améliorera la séparation des différentes espèces d’acides nucléiques en éliminant toutes les structures secondaires qui peuvent être présentes. À l’aide d’une pipette sérologique de deux millilitres, appliquez rapidement la solution d’acide nucléique sur l’appétit hydroxylé, en veillant à ne pas perturber la colonne.

Une fois que les 500 microlitres s’écoulent sur la colonne, une petite quantité de tampon phosphate de 0,12 molaire peut être ajoutée au sommet de la colonne pour éviter qu’elle ne se dessèche. Laissez les acides nucléiques se lier à l’appétit hydroxyle pendant 30 minutes. Après l’incubation de liaison, placez un tube conique de 15 millilitres sous la colonne.

Ouvrez ensuite le robinet d’arrêt et prélevez l’échantillon initial de 500 microlitres, qui contient de l’ADN simple brin. Une fois que 500 microlitres ont été collectés, fermez le robinet d’arrêt. Ensuite, ajoutez six millilitres de tampon de phosphate de 0,12 molaire à l’appétit hydroxy, en veillant à ne pas perturber la colonne.

Ouvrez ensuite le robinet d’arrêt et continuez à collecter le flux contenant de l’ADN briné singulet dans le même tube de 15 millilitres que celui de l’étape précédente. Une fois qu’environ six millilitres ont été collectés, fermez le robinet d’arrêt. Ajouter un volume d’une solution d’alcool isoamylique phénol chloroforme dans le tube mélangé vigoureusement par vortex, puis centrifuger à 3 500 fois G pendant 15 minutes.

Après la centrifugation, le tube contiendra deux couches. Transférez la couche d’acquiescement supérieure, qui contient le brin unique d’ADN dans un nouveau tube de 15 millilitres, et stockez l’échantillon à température ambiante pour éluer et purifier l’ARN de la colonne, ajoutez six millilitres de tampon de phosphate de 0,20 molaire et collectez les écoulements avant d’utiliser un nouveau tube de 15 millilitres. Effectuez ensuite une extraction au phénol chloroforme.

En ce qui concerne l’échantillon d’ADN simple brin, répétez ce processus en utilisant six millilitres de tampon de phosphate de 0,40 molaire pour éluer et purifier l’ADN double brin de la colonne. Enfin, pour débarrasser la colonne de tout ADN double brin résiduel. Répétez ce processus une fois de plus.

Cette fois-ci, en utilisant six millilitres de tampon phosphate de 1,00 molaire pour dessaler les échantillons d’acide nucléique. Transférez quatre à cinq millilitres de chaque échantillon dans un dispositif de filtre centrifuge Ultra Four équipé d’un échantillon de concentré de membrane ultracellulaire de 30 000 poids moléculaire à moins de 500 microlitres en tournant à 6 000 GS à 30 degrés Celsius pendant environ cinq minutes dans un rotor à angle fixe. Après avoir éliminé le flux, ajoutez le reste des échantillons dans le filtre.

Portez le volume à quatre à cinq millilitres avec un tampon XTE sans ARN. Puis tournez à nouveau jusqu’à ce qu’un volume concentré soit atteint. Environ cinq minutes après la rotation, ajoutez quatre à cinq millilitres d’ARN libres d’un tampon XTE au filtre et concentrez-vous.

Encore une fois, répétez ce lavage et cinq fois supplémentaires pour dessaler complètement les échantillons d’acide nucléique. Une fois que les échantillons ont été complètement concentrés et dessalés, transférez les échantillons d’acide nucléique restants dans un microtube à centrifuger stérile de 1,7 millilitre. Précipitez les acides nucléiques en ajoutant un dixième du volume d’acétate de sodium, deux volumes d’éthanol à 100 % et un microlitre de bleu de glyco bien mélangé par centrifugeuse vortex.

A 28 000 GS quatre degrés Celsius. 60 minutes jusqu’au Kent. Assurez-vous de ne pas déranger le granulé.

Ajoutez 300 microlitres de spin à 70 % d’éthanol à température ambiante de 28 000 GS pendant 10 minutes pour ne pas sécher et remettez en suspension chaque fraction dans un volume approprié d’ARN. Tampon TE libre : des concentrations égales des acides nucléiques viraux M 13 MP 18, ADN simple brin MS deux simple brin, ARN FI six double brin, ARN et lambda double brin ont été combinés, puis séparés par chromatographie hydroxyapatite, comme le montre cette vidéo. Des concentrations égales de M 13 MP 18, d’ADN simple brin MS deux, simple brin, d’ARN cinq six double brin, d’ARN et d’ADN double brin Lambda ont été combinées comme indiqué dans la voie six et appliquées à une colonne d’hydroxyapatite comme on peut le voir ici.

L’ADN simple brin D-N-A-R-N-A et l’ADN double brin ont été indépendamment séparés de la colonne d’hydroxyapatite à l’aide d’un tampon phosphate de 0,12 molaire, 0,18 molaire, 0,40 molaire et 1,00 molaire. Une échelle d’un Ko a été utilisée pour confirmer la taille du génome. Ces résultats indiquent que cette méthode peut être utilisée pour séparer avec succès l’ADN simple brin, l’ADN double brin et l’ARN avec moins de 9 % de transfert d’une fraction à l’autre.

Cette méthode a également été utilisée pour séparer les acides nucléiques isolés d’une communauté virale dans la baie de Chesapeake, comme le montre ici. L’ADN simple brin D-N-A-R-N-A et l’ADN double brin ont été attribués indépendamment à l’aide de concentrations de tampon phosphate de 0,12 molaire, 0,20 molaire et 0,40 molaire, ou 1,00 molaire respectivement, une échelle d’ADN de masse élevée dans la première voie et une échelle KB dans la deuxième voie ont été utilisées pour confirmer visuellement la masse moléculaire approximative et la masse des acides nucléiques, comme on peut le voir ici, l’ADN double brin était le type d’acide nucléique dominant extrait du plancton Verio de la baie de Chesapeake. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de séparer les acides nucléiques d’un assemblage viral mixte à l’aide de la chromatographie à l’hydroxyapatite.

Cela comprend la préparation de la colonne d’hydroxyapatite et des acides nucléiques, la séparation et l’illusion des acides nucléiques à l’aide de diverses concentrations de tampon phosphate et le dessalage, et la concentration des acides nucléiques après la séparation.