Immunomarquage de protéines membranaires neuronales dans un échantillon de tissu cérébral de souris fracturé par congélation

Prenez un échantillon de tissu cérébral de souris fracturé par congélation dans un tampon.

L’échantillon est recouvert de platine pour améliorer les détails de surface et de carbone pour la stabilité structurelle.

Transférez l’échantillon dans un flacon avec un tampon de digestion contenant du détergent.

Incuber pour faciliter la dégradation des tissus, en laissant intacts la membrane et les protéines incrustées dans l’enrobage.

Laver avec un tampon pour enlever les débris.

Ajoute une solution de blocage pour empêcher la liaison d’anticorps non spécifiques.

Introduire des anticorps primaires spécifiques à la protéine membranaire neuronale cible.

Laver avec un tampon pour éliminer les anticorps non liés.

Incuber avec des anticorps secondaires conjugués à l’or qui se lient aux anticorps primaires.

Laver avec un tampon pour éliminer les anticorps en excès.

Rincez à l’eau pour éviter les artefacts provenant des résidus de sel pendant la microscopie.

Montez l’échantillon sur un microscope électronique à transmission ou une grille TEM.

Sous le MET, visualisez la protéine de membrane neuronale cible identifiée par des particules d’or, qui apparaissent sous forme de points noirs.

Pour la digestion par SMS, transférez une réplique dans un flacon en verre de 4 millilitres rempli de 1 millilitre de tampon de digestion SDS. Laissez-le digérer pendant 18 heures à 80 degrés Celsius en le secouant. Pour l’immunomarquage, laver la réplique pendant 10 minutes dans un tampon de digestion SDS frais. Ensuite, incubez-le avec des anticorps primaires et secondaires dilués dans 2 % de BSA TBS dans une chambre humide à 15 degrés Celsius pendant 24 à 72 heures.

Ensuite, montez la réplique sur une grille de barres parallèles de 100 lignes recouverte d’un formvar. Imagez la réplique avec un microscope électronique à transmission à 80 ou 100 kilovolts. Acquérez ensuite les images numériques à l’aide d’une caméra CCD.