Immunomarquage de neurones dans des tranches de cerveau de souris suite à une hybridation in situ par fluorescence

Prenez des tranches de cerveau de souris fixes et perméabilisées contenant des neurones, y compris des neurones cholinergiques exprimant la choline acétyltransférase.

Les coupes sont soumises à une hybridation in situ fluorescente pour détecter les ARNm cibles localisés aux axones cholinergiques, ce qui permet d’amplifier les signaux à l’aide de sondes fluorescentes, qui sont détectées par microscopie à fluorescence.

Ajouter une solution bloquante contenant des protéines et un agent d’extinction. Les protéines empêchent la liaison non spécifique et l’agent de trempe neutralise les fixateurs résiduels.

Incuber avec des anticorps primaires qui ciblent la choline acétyltransférase neuronale.

Laver avec un tampon pour éliminer les anticorps non liés.

Incuber avec des anticorps secondaires conjugués au fluorophore qui se lient aux anticorps primaires liés à la choline acétyltransférase.

Laver avec un tampon pour éliminer l’excès d’anticorps, puis rincer à l’eau distillée pour éliminer les résidus de tampon.

Montez les tranches avec un support de montage contenant une coloration nucléaire pour marquer les noyaux.

À l’aide de la microscopie à fluorescence, imagez les coupes pour visualiser les signaux d’ARNm cibles et les axones cholinergiques colorés avec des anticorps spécifiques.

Recouvrez chaque tranche de 100 à 200 microlitres de solution bloquante, contenant trois milligrammes par millilitre de BSA, 100 millimolaires de glycine et 0,25 % de Triton X-100 dans du PBS. Recouvrez chaque lame d’un parafilm et incubez pendant 30 minutes à température ambiante.

Après l’incubation, à 100 à 200 microlitres d’anticorps dilués dans une solution bloquante sur les lames, un anticorps anti-choline acétyltransférase est utilisé ici. Après avoir été recouvertes, les lames avec du parafilm incubent pendant deux jours à quatre degrés Celsius. Assurez-vous que les tranches de cerveau ne se dessèchent pas. Si nécessaire, réappliquez la solution d’anticorps anti-chAT sur les tranches de cerveau 24 heures après l’incubation.

Après avoir lavé les lames trois fois dans 1X PBS pendant cinq minutes à température ambiante, ajoutez 100 à 200 microlitres de l’anticorps secondaire conjugué Alexa approprié aux lames. Couvrir de parafilm et incuber pendant une heure à température ambiante à l’abri de la lumière.

Une fois l’heure écoulée, lavez les lames trois fois dans 1X PBS pendant cinq minutes chacune comme auparavant, puis lavez-les une fois à l’eau distillée. Montez les diapositives avec un support de montage contenant du DAPI. Et puis visualisez les tranches de cerveau sous le microscope à fluorescence.