Réalisation d’une immunohistochimie sur le tissu cérébral d’un primate non humain

Commencez par une section de cerveau de primate non humain fixée chimiquement.

Le fixateur à base d’aldéhyde réticule les protéines, préservant la structure des tissus, mais laisse des résidus d’aldéhyde réactifs.

Lavez pour enlever la couche cryoprotectrice entourant la section de tissu.

Ajouter un agent réducteur pour neutraliser les groupes aldéhydes réactifs, produisant des sous-produits de réaction.

Lavez pour éliminer ces sous-produits et l’excès d’agents réducteurs.

Appliquez une solution bloquante pour empêcher la liaison d’anticorps non spécifiques.

Ajouter des anticorps primaires ciblant une protéine exprimée sur des sites spécifiques de la membrane neuronale.

Laver pour éliminer les anticorps non liés.

Ajouter des anticorps secondaires biotinylés ciblant les anticorps primaires.

Laver pour éliminer les anticorps non liés.

Superposer avec des complexes avidine-biotine-peroxydase qui se lient aux anticorps secondaires.

Laver à nouveau pour éliminer les complexes non liés.

Introduisez un substrat chromogène avec du peroxyde d’hydrogène. En présence de peroxyde d’hydrogène, l’enzyme peroxydase oxyde le substrat, formant des précipités bruns.

Commencez par transférer des sections de 50 microns d’épaisseur de cerveau de primate non humain fixé à l’acroléine, contenant la région d’intérêt, vers une plaque à 12 puits contenant du PBS. Lavez les sections flottantes trois fois dans du PBS pendant cinq minutes à température ambiante. Ensuite, incubez les sections dans une solution de borohydrure de sodium fraîchement préparée pendant 30 minutes à température ambiante. Balancez-vous doucement sans couverture.

Une fois les 30 minutes écoulées, aspirez le borohydrure de sodium et ajoutez du PBS dans chaque puits. Placez l’assiette sur une bascule et secouez vigoureusement pendant 10 minutes. Répétez le lavage deux fois de plus, ou jusqu’à ce qu’il ne reste plus de gaz de réaction. Bloquez les sections en les incubant dans une solution de sérum normal à 2 % et de gélatine de poisson froide à 0,5 %, diluée dans du PBS pendant une heure à température ambiante avec un léger balancement.

Une fois le temps d’incubation écoulé, incubez les sections et la solution d’anticorps primaires en les berçant doucement pendant la nuit à température ambiante. Le lendemain, après avoir lavé les sections comme précédemment, incubez les sections dans une solution d’anticorps secondaire pendant 1,5 heure à température ambiante avec un léger balancement. Après avoir lavé les sections comme précédemment, incubez dans de l’avidine biotin peroxydase, ou solution ABC, pendant une heure à bascule.

Ensuite, préparez une solution fraîche de 3,3-diaminobenzidine à 0,05 % avec du peroxyde d’hydrogène à 0,005 % dilué dans du TBS. Après le lavage, incubez des sections dans la solution DAB pendant trois à sept minutes avec un balancement doux. Une fois que le précipité brun s’est développé jusqu’à la couleur souhaitée, arrêtez la réaction en lavant rapidement deux fois à froid, puis à travers une série de lavages TBS et PB chronométrés.