La quantification et l'analyse de la formation de HO-endonucléase Stimulé par les translocations chromosomiques simple brin recuit dans Saccharomyces cerevisiae

L’objectif global de cette procédure est de déterminer le contrôle génétique de la formation de la translocation par agenouillement simple brin dans des cellules de levure bourgeonnantes diploïdes. Pour ce faire, on inocule d’abord des cultures avec des colonies uniques d’un génotype spécifique et on les cultive pendant la nuit. La deuxième étape de la procédure consiste à induire la formation simultanée de cassures double brin par endonucléase ho sur deux chromosomes par l’ajout de galactose aux cultures.

Ensuite, la dilution de ces cultures est plaquée sur des milieux sélectifs et non sélectifs. La dernière étape consiste à déterminer la fréquence de translocation en comptant les colonies qui se forment sur des milieux sélectifs et non sélectifs. En fin de compte, on peut obtenir des résultats qui montrent un contrôle génétique de la formation de la translocation par un seul brin, un agenouillement à travers des changements dans la fréquence de la formation de translocation stimulée par ho dans des souches de différents génotypes.

Les implications de cette technique s’étendent aux conséquences de l’exposition aux rayonnements thérapeutiques des patients cancéreux, car les cassures double brin de l’ADN et la formation de translocation sont les principales conséquences de ce traitement. Pour commencer la procédure de détermination des fréquences de translocation stimulées par ho, inoculez 10 à 20 cultures indépendantes d’un millilitre de milieu de lactate de glycérol à pic Y avec des colonies uniques du génotype souhaité, incubez les cultures pendant la nuit à 30 degrés Celsius sur un rotateur. Lorsque les cultures ont atteint la densité cellulaire souhaitée, ajoutez 20 % de galactose aux cultures jusqu’à une concentration finale de 2 %Le galactose induira l’expression de l’endonucléase ho, qui dirigera les cassures double brin au niveau de l’allèle historique delta cinq prim sur le chromosome trois et a trois allèle delta trois prim sur le chromosome 15 incuber pendant quatre heures à 30 degrés Celsius sur un rotateur.

L’étape suivante est essentielle au succès de la procédure. Une dilution et un placage soigneux des cultures sont impératifs. Si vous obteniez des fréquences de translocation suffisamment reproductibles pour permettre des comparaisons statistiquement significatives entre des souches de génotypes différents, après quatre heures, la dilution appropriée des cultures sur un milieu dépourvu d’histidine ainsi que sur YPD td environ 100 à 200 colonies par plaque d’incubation à 30 degrés Celsius pendant deux à trois jours.

Lorsque des colonies apparaissent, la fréquence de translocation peut être déterminée. L’efficacité du placage avant et après l’induction de l’expression de l’endonucléase ho indiquera si la présence ou l’absence de l’un ou l’autre des chromosomes de translocation affecte la capacité à survivre à la formation de DSB. Cela fragmente une copie du chromosome trois et du chromosome 15 pour déterminer l’efficacité du placage avant l’induction.

Tout d’abord, prélevez une aliquote de cellules de chaque culture de nuit et déterminez le nombre de cellules en comptant avec un hémocytomètre. Ensuite, utilisez une dilution appropriée pour plaquer environ 100 à 200 cellules sur YPD et incuber pendant deux à trois jours à 30 degrés Celsius jusqu’à ce que des colonies se forment. Ajoutez 20 % de galactose aux cultures restantes jusqu’à une concentration finale de 2 % et incubez à 30 degrés Celsius pendant quatre heures pour déterminer l’efficacité du placage après induction.

Prélever une aliquote de cellules de chaque culture après quatre heures d’induction et déterminer le nombre de cellules à l’aide d’une plaque de comptage à l’aide d’une plaque d’environ 100 à 200 cellules à l’aide d’une dilution appropriée sur YPD Incuber pendant deux à trois jours à 30 degrés Celsius jusqu’à ce que des colonies apparaissent. Une fois que des colonies se forment sur les plaques, l’efficacité du placage peut être déterminée. Les clones porteurs de translocation présumée peuvent être examinés par transfert austral.

Cette procédure utilise de l’ADN génomique préparé à partir d’un seul sifflement et d’une colonie recombinante de chaque essai indépendant, digère environ quatre microgrammes de chaque échantillon d’ADN avec BAM H, une endonucléase de restriction, sépare BAM H, un fragment digéré sur un aros à 0,7 %, puis transfère sur une membrane de nylon chargée positivement hybridée avec une sonde marquée P 32 obtenue par amorçage aléatoire avec un clone génomique de 1,8 KILOBASE BMH, un BMH un clone génomique contenant le HIS trois gènes. Visualisez des fragments d’ADN par autoradiographie ou imagerie phospho. Une autre façon d’examiner les clones porteurs de translocation présumée est l’analyse du tracé des chromosomes.

Les chromosomes sont d’abord préparés à partir de sifflements et de recombinants sélectionnés dans des bouchons aros, des chromosomes séparés sur un gel aros à 1 % dans un champ électrique homogène serré ou chef à 14 degrés Celsius. Les paramètres suivants sont utilisés : premier bloc de 14 degrés Celsius, 72e temps de commutation et 15 heures à six volts centimètre, deuxième bloc, 14 degrés Celsius, 122e temps de commutation et 11 heures à six volts par centimètre. À la fin de l’électrophorèse, visualisez les chromosomes en colorant le gel avec du bromure AUM pendant 30 minutes, puis en irradiant avec des UV et en retenant et en transférant les chromosomes à une membrane chargée positivement par capillarité.

Les conditions de dénaturation s’hybrident avec la sonde marquée au P 32 obtenue par amorçage aléatoire avec un clone génomique de 1,8 kilobase bam H, un bam H, un clone génomique contenant le sifflement. Trois gènes visualisent les chromosomes par autoradiographie ou imagerie phospho. La fréquence des translocations chromosomiques peut être calculée en divisant le nombre de colonies phototrophes d’histamine par le nombre total de cellules viables déterminé par placage sur YPD.

Dans cet exemple, la fréquence de recombinaison calculée est d’environ 3 %. Un agenouillement comme le montre ce graphique représentatif. Les fréquences de translocation obtenues à la fois sélectivement et non sélectivement avec l’homozygote nul delta RAD 51 étaient statistiquement différentes de celles obtenues en utilisant les conditions correspondantes avec la souche de type sauvage avant et après le placage par induction.

L’efficacité est déterminée en divisant le nombre total de cellules viables formant des colonies par le nombre total de corps cellulaires dans la culture déterminée par le nombre de cytomètres hémologiques, comme le montre ce tableau, avant et après le placage d’induction. Les efficacités n’étaient pas significativement différentes pour les cellules de type sauvage, ce qui suggère que la présence ou l’absence de l’un ou l’autre des chromosomes de translocation n’affecte pas la capacité de survie. Formation de DSB.

Les clones porteurs de translocation présumée peuvent être examinés par analyse génomique par transfert de Southern. Une représentation graphique des chromosomes pertinents avant et après la formation de la translocation est présentée ici. Tailles des fragments de restriction contenant des séquences pertinentes générées par la digestion de l’ADN génomique de BAM H à partir de souches parentales et recombinantes et révélées par transfert par hybridation avec une BAM H de 1,8 kilobase.

Ses trois clones génomiques sont répertoriés en paires de kilobases pour l’analyse par transfert de Southern. L’ADN génomique est digéré avec une endonucléase BMH et hybridé en un P 32 marqué 1,8 kilobase. Les trois sondes HIS permettent de visualiser ces fragments diagnostiques.

0,8 kilobase HIS trois delta 201,7 kilobase sifflement trois delta trois prime quatre kilobase T 3 15 5 kilobase T 15 trois et huit kilobase sifflement trois delta cinq fragments premiers. La voie A est le diploïde parent. La voie B est une translocation réciproque sifflante plus et la voie C est une translocation réciproque plus sifflement.

L’analyse chromosomique recombinante BLO peut également être utilisée pour examiner les clones porteurs de translocation. Les chromosomes intacts préparés dans des bouchons aros sont séparés par électrophorèse du chef et le gel coloré au bromure d’iridium et visualisé sous lumière UV. Les chromosomes séparés sont ensuite compressés en nylon et hybridés avec le P 32 marqué 1,8 kilobase.

Sa sonde trois pour visualiser le chromosome intact de 1,1 mégabase, la mégabase 15,8, le chromosome de translocation T 15 trois, le chromosome de translocation 0,6 mégabase T, le chromosome de translocation 15 et le chromosome trois intact de 0,3 mégabase. La voie A est le parent déployé. La voie B est A son recombinant de translocation non réciproque, et la voie C est son recombinant de translocation réciproque plus.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de déterminer la fréquence de formation de la translocation après plusieurs cassures double brin stimulées par ho.