Name: La quantification et lanalyse de la formation de HO-endonucléase Stimulé par les translocations chromosomiques simple brin recuit dans Saccharomyces cerevisiae /em (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Découvrez l'analyse des translocations chromosomiques induites par HO-endonucléase chez Saccharomyces cerevisiae. Cette méthode permet d'étudier le contrôle génétique des cassures double-brin et leur réparation par recuit de brin simple.

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Ce travail a été soutenu par des fonds du National Institutes of Health et l&#39;Institut de recherche Beckman de la ville de Hope. Nous tenons à remercier les réviseurs pour leurs commentaires constructifs qui ont ajouté la clarté du manuscrit.

1. Fréquences translocation HO-stimulé <ol><li> Inoculer 10-20 indépendante cultures de 1 ml de YPGly / Lac moyenne (1% extrait de levure, peptone à 2%, glycérol 3% et 3% de lactate) avec des colonies isolées du génotype désiré. Incuber les cultures de la nuit, ou pendant une durée suffisante pour atteindre une densité cellulaire d'environ 5x10 7-1x10 8 cellules / ml, à 30 ° C sur un agitateur, ou avec une légère agitation. </li><li> Ajouter galactose à la culture à une concentration finale de 2% pour induire HO endonucléase dirigée CDB à l'his3-Δ3 »(chromosome III) et his3-Δ5» (chromosome XV) substrats de translocation. </li><li> Incuber pendant 4 h à 30 ° C sur un agitateur, ou avec une légère agitation. </li><li> Après 4 h, les dilutions plaque appropriée des cultures sur YPD (extrait de levure 1%, 2% de peptone, 2% de dextrose) pour donner environ 100 à 200 colonies par plaque, et un nombre suffisant de cellules sur milieu dépourvu d'histidine à céder une observable nombre de ses colonies + recombinant. Incuber les plaques à 30 ° C pendant deux à trois jours. </li></ol> REMARQUE: Etape 1.4 décrit la détermination des fréquences de la translocation dans des conditions sélectives en étalant les cultures sur l'histidine manquent moyenne. Ce test peut également être menée sous conditions non sélectives en étalant sur des cultures YPD, puis réplique-placage des colonies qui se posent sur-Sa plaques deux à trois jours plus tard. Ces méthodes produisent des fréquences similaires de translocation (figure 2C). <ol start="5"><li> Déterminer la fréquence de translocation en divisant le nombre de colonies prototrophes histidine par le nombre total de cellules viables plaqués (déterminé par dilutions placage sur YPD). Déterminer la fréquence médiane et la translocation 95% intervalle de confiance 15. </li></ol> 2. Efficacités Placage <ol><li> Retirer une aliquote de cellules de chaque culture de la nuit, et de déterminer le nombre de cellules par hématimètre count (Baxter Healthcare Corporation Catolog #:. B3178-1). </li><li> Plaque d'environ 100 à 200 cellules en utilisant une dilution appropriée sur YPD. Incuber pendant deux à trois jours à 30 ° C (par exemple pour une culture avec une densité cellulaire de 1x10 8 cellules / ml, on devrait plaque de 100 à 200 pi d'une dilution 10-5 par plaque). </li><li> Ajouter galactose à 20% pour les cultures à une concentration finale de 2%. </li><li> Après 4 h, enlever une partie aliquote de cellules de chaque culture, de déterminer le nombre de cellules par comptage hématimètre, et la plaque d'environ 100 à 200 cellules en utilisant une dilution appropriée sur YPD. Incuber pendant deux à trois jours à 30 ° C. </li><li> Déterminer l'efficacité plaquage en divisant le nombre de colonies apparaissant sur YPD par le nombre de cellules étalées, et en multipliant ce quotient par 100. Déterminer le pourcentage médian avec un intervalle de confiance à 95%. </li></ol> 3. Genomic analyse par Southern blot <ol><li> Sélectionnez une seule colonie de Sa + recombinantes à partir de chaque essai indépendant et préparer l'ADN génomique 16. </li><li> Recueil d'environ 4 pg d'ADN par l'endonucléase de restriction BamHI. </li><li> Séparée digéré par BamHI de fragments sur un gel d'agarose 0,7%, et le transfert d'une membrane de nylon chargée positivement (Hybond N +, GE Healthcare Product Code:. RPN303B) 17. </li><li> S'hybrider avec une 32 P-sonde marquée obtenus par amorçage aléatoire (Amersham Biosciences Code du produit:. RPN1604) avec un 1,8 kb BamHI / BamHI clone génomique contenant le gène HIS3. </li><li> Visualisez les fragments d'ADN par autoradiographie ou phosphorimaging. </li></ol> 4. Une analyse par transfert de chromosomes en utilisant des chromosomes séparés dans un contour serré homogène du champ électrique (CHEF): <ol><li> Préparer les chromosomes de ses recombinants sélectionnés + dans les bouchons d'agarose 18: <ul><li> Cultiver une culture liquide de Son candidat + TXV:: III chromosome recombinant contenant dans 5 ml de YPD à environ 1-2 x 10 8 cellules / ml. </li><li> Isoler et laver les cellules deux fois avec 50 mM d'EDTA. </li><li> Resuspendre les cellules dans environ 200 pi d'EDTA 50 mM, et chaude à 50 ° C. </li><li> Ajouter un volume égal de liquide de 2% (p / v) faible fondre agarose portée à 50 ° C, bien mélanger. </li><li> Répartir environ 80 aliquotes dans des moules fiche, et les laisser refroidir pendant 30 min à 4 ° C. </li><li> Extruder les bouchons du moule dans un plat de 12 puits. Jusqu'à cinq fiches peuvent être placés dans chaque puits. </li><li> Ajouter 3 ml de solution sphéroplastes fraîchement préparés (14 mM de 2-β-mercaptoéthanol, 20 mM d'EDTA, 0,5 mg / ml Zymolyase 20T, 10 mM Tris-HCI, pH 7,5, 1 M sorbitol) à chaque puits. Incuber à 37 ° C pendant 4 heures avec une agitation douce. </li><li> Retirer et remplacer la solution sphéroplastes avec 3 ml de solution de LDS (10 mM Tris-HCI, pH 8,0, 100 mM d'EDTA, 1% (p / v) de dodécylsulfate de lithium, adjuspH à 8,0 t). Incuber à 37 ° C pendant 15 min avec agitation douce. </li><li> Retirer solution de LDS et le remplacer par une autre partie aliquote de 3 ml de LDS. Incuber à 37 ° C pendant une nuit sous agitation douce. </li><li> Retirer et remplacer LDS avec 3 ml de 0,2 X NDS (0,6 g de Tris base, 93 g EDTA disodique dihydraté, 5 g de N-lauroyl sarcosine, ajuster le pH à 8,0, porté à 500 ml avec dH 2 O). Incuber à température ambiante pendant 30 min avec agitation douce. Retirer NDS, et répéter 2 fois. </li><li> Retirer et remplacer NDS avec 3 ml de TE. Laver avec une légère agitation pendant 30 min à température ambiante. Répétez 4 fois. </li><li> Magasin de bouchons à 4 ° C dans 2 ml de TE. Bouchons peut se conserver jusqu'à un an. </li></ul></li><li> Chromosomes distincts sur un gel à 1% d'agarose en utilisant un Bio-Rad CHEF-DRII appareil à 14 ° C (Catalogue #: 170-3612). </li></ol> Paramètres: 1 Bloc er: changer l'heure 70, 15h à 6V/cm. 2 ème bloc: changer l'heure 120s, 11h au 6V/cm <ol start="3"><li> Visualisez les chromosomes par coloration au bromure d'éthidium 1μg/ml pendant 30 min, irradiant avec 60 mJ d'UV dans un Stratalinker UV (Stratagene), et de-coloration pendant 30 min dans dH 2 O. Irradiant de bromure d'éthidium chromosomes colorés entailles de l'ADN pour permettre le transfert efficace de la membrane. </li><li> Transfert des chromosomes à une membrane chargée positivement (Hybond N +, GE Healthcare Product Code:. RPN303B) par capillarité dans les conditions dénaturantes (NaOH 0,4 N, 1,5 M de NaCl). </li><li> S'hybrider avec une 32 P-sonde marquée obtenus par amorçage aléatoire (Amersham Biosciences Code du produit:. RPN1604) avec un clone génomique de 1,8 kb BamHI / BamHI contenant le gène HIS3 17. </li><li> Visualisez les chromosomes par autoradiographie ou phosphorimaging. </li></ol> 5. Les résultats représentatifs: Une représentation graphique de l'essai de translocation est représenté au niveau chromosomique (Figure 1). Un schéma de la procédure expérimentale est également affichée (figure 2A). Les deux pré-et efficacités plaquage post-induction sont déterminés en divisant le nombre total de cellules viables colonie, formant par le nombre total de corps cellulaires dans la culture déterminée par hématimètre comptage (figure 4B). Pré-et de l'efficacité plaquage post-induction ne sont pas significativement différentes pour les cellules de type sauvage (valeur p = 0,1400) (tableau 1). <img src="/files/ftp_upload/3150/3150table1.jpg" alt="Tableau 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Tableau 1"> Tableau 1. Pré-et de l'efficacité plaquage post-induction dans les cellules de type sauvage. a Le nombre de corps cellulaires par millilitre sont déterminées par comptage hématimètre. b Le nombre de cellules viables par millilitre sont déterminées par étalement des dilutions appropriées sur milieu non sélectif pour produire ~ 100-200 colonies. c Les pré-et efficacités plaquage post-induction sont déterminés en divisant le nombre total d'entreprises viables, formant colonie, les cellules par le nombre total de corps cellulaires dans la culture, déterminée par le nombre hématimètre. Cela suggère que la présence ou l'absence d'une translocation chromosomique soit n'affecte pas la capacité de survivre à la formation de l'ORD. La fréquence des translocations chromosomiques peuvent être calculés en divisant le nombre de colonies prototrophes histidine par le nombre total de cellules viables déterminé par étalement sur ​​YPD (figure 2B). Ce test peut être effectué en utilisant des souches de génotype différent de déterminer comment la perte de la fonction des protéines affecte l'Afrique subsaharienne (soit rad51Δ - / -). Fréquences de recombinaison déterminée dans différentes souches peuvent alors être représentées graphiquement pour comparer les différences dans la capacité de ces souches pour réparer les CDB endonucléase HO-induite par l'ASS (figure 2C). Translocation fréquences obtenues avec la souche diploïde sauvage de type en vertu sélective (2.2x10 -2) et non sélectif (2.17x10 -2) les conditions n'étaient pas statistiquement différents les uns des autres (valeur p = 0,9131), tandis que les fréquences obtenues translocation sélective (6.0x10 -2) et non sélective (11.9x10 -2) avec le rad51Δ - / - homozygotes étaient similaires, mais statistiquement différentes (valeur p = 0,0089). Les fréquences obtenues à la fois sélective (valeur p = 0,0001) et non sélective (valeur p = 0,0002) avec le ¨ Rad51 - / - homozygotes étaient statistiquement différents de ceux obtenus en utilisant les conditions correspondant à la souche de type sauvage. Putatifs translocation portant des clones peut être encore examiné par Southern blot génomiques et les analyses chromosomiques (figure 3). Pour une analyse de Southern, l'ADN génomique est digéré par une endonucléase BamHI avant électrophorèse sur gel, buvard et d'hybridation pour une 32P-étiquetés 1.8kb HIS3 sonde pour visualiser le diagnostic de 0,8 kb his3Δ200, 1,7 kb his3-Δ3 ', 4 ko TIII:: XV, 5 ko TXV:: III, et 8 ko his3-Δ5 «fragments (figure 3B.1) . Chromosomes intacts peuvent être préparés, séparés par le chef (figure 3B.2), effacés au nylon et hybrides avec le P-32 étiqueté 1,8 kb HIS3 sonde pour visualiser les chromosomes intacts 1.1 Mo XV, 0,8 Mb TXV: chromosome translocation III, 0.6 Mo TIII: chromosome translocation XV, et de 0,3 Mb du chromosome III intacte (figure 3B.3). Une carte graphique illustrant devrait BamHI endonucléase digérée fragments d'ADN génomique, et les parents et les chromosomes recombinants, est représenté (figure 3A). <img src="/files/ftp_upload/3150/3150fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Formation des chromosomes par translocation simple brin recuit (ASS). 1) CDB sont créés à l'his3-Δ3 et his3-Δ5 «substrats (chromosomes XV et III, respectivement) par endonucléase HO suite à l'ajout de galactose à la culture. 2) CDB sont traitées pour produire 3 'simple-brins aux extrémités des chromosomes cassés. 3) recuits machines ASS 311 nucléotides complémentaires ou 60 simple brin HIS3 séquences formées à chacun des substrats de recombinaison. Non homologue queues formées lors de recuit sont éliminés par digestion par des endonucléases. Complémentaire quatre surplombe pb sur les fragments restants chromosomiques formé par la digestion d'endonucléase HO-peut aussi recuit. 4) La ligature conclut la création d'un gène HIS3 intacte et TXV:: chromosome translocation III par l'ASS. Cellules porteuses du chromosome présent peuvent être sélectionnées par leur capacité à croître sur l'histidine manquent moyenne. La ligature peut aussi générer la réciproque TIII:: chromosome translocation XV par un mécanisme de NHEJ-like. <img src="/files/ftp_upload/3150/3150fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Essai pour déterminer la fréquence de la translocation par le SSA. A) Un ml YPGly / Lac cultures sont inoculées avec des colonies de cellules unique d'un génotype de sélectionner et s'est développée à une densité appropriée d'environ 5x10 7-1x10 8 cellules / ml. Le galactose est ajouté à une concentration finale de 2% pour créer des CDBs dans les substrats de recombinaison des chromosomes III et XV. Pour effectuer le test dans des conditions sélectives, des dilutions appropriées sont faites de telle sorte que d'environ 100 à 200 cellules sont étalées sur YPD et un nombre suffisant de cellules sont étalées sur l'histidine manquent moyenne pour produire un certain nombre de ses colonies observables + recombinant. Pour effectuer le test sans sélection, environ 100 à 200 cellules sont étalées sur YPD, cultivées pendant deux à trois jours pour des colonies isolées puis réplique plaquée sur l'histidine milieu dépourvu. B) la fréquence de translocation peut être déterminé en divisant le nombre de colonies qui poussent sur-Sa plaques par la fraction qui poussent sur YPD. C) Les fréquences translocation des souches de génotype différent (c'est à dire de type sauvage et rad51Δ - / -) peuvent être représentées graphiquement pour comparer les différences dans la capacité de ces souches pour réparer les CDB en Afrique subsaharienne. <img src="/files/ftp_upload/3150/3150fig3.jpg" alt="Figure 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> Figure 3. Déterminer l'efficacité de placage. (A) Une aliquote de cellules est tirée de la culture de la nuit avant et après l'induction ORD, des dilutions appropriées sont prises, suivie par un nombre de hématimètre pour déterminer le nombre total de corps cellulaires par ml de culture. Des dilutions appropriées sont étalées sur un milieu non sélectif pour déterminer le nombre total de cellules viables par ml, en comptant les colonies qui apparaissent sur YPD. (B) L'efficacité d'étalement est alors déterminé en divisant le nombre total de cellules viables par le nombre total de corps cellulaires, et en multipliant ce quotient par 100. <img src="/files/ftp_upload/3150/3150fig4.jpg" alt="Figure 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 4"> Figure 4. Détection des événements translocation chromosomique par Southern blot génomiques et analyses par transfert de chromosomes. A) Représentation graphique des chromosomes concernés avant (à gauche) et après la formation de translocation (à droite). Tailles des parents et des chromosomes recombinés sont énumérés dans mégabase paires (Mo). Tailles des fragments de restriction contenant des séquences pertinentes générées par digestion BamHI de l'ADN génomique de parent et les souches recombinantes, et a révélé sur des transferts par hybridation avec un clone de 1,8 kb BamHI HIS3 génomique, sont énumérés dans kilobase-paires (ko). Les chromosomes ne sont pas dessinés à l'échelle. B) Analyse physique de putatifs translocation portant des clones. (1) L'analyse génomique par Southern blot - ADN génomique a été recueilli et digéré par l'endonucléase de restriction BamHI, fractionné par électrophorèse sur gel, blotted au nylon, et hybridé à un P-32 étiqueté 1,8 kb HIS3 sonde pour visualiser les fragments suivants: 0,8 kb his3Δ200, 1,7 kb his3-Δ3 ', 4 ko TIII:: XV, 5 ko TXV:: III, et 8 ko his3-Δ5 ». Lanes: un parent diploïde), b) Son + non réciproques translocation recombinantes, c) Sa translocation réciproque + recombinant. (2) CHEF gels - chromosomes intacts ont été préparées dans les bouchons d'agarose, séparés par le chef, coloré avec du bromure d'éthidium et visualisé sous lumière UV. Lanes: Comme ci-dessus. (3) efface chromosomes - chromosomes séparés ont été effacés au nylon et hybrides avec le P-32 étiqueté 1,8 kb HIS3 sonde pour visualiser les chromosomes suivants: 1.1 Mo chromosomes intacts XV, 0,8 Mb TXV: chromosome translocation III, 0,6 Mb TIII: translocation XV chromosome, et de 0,3 Mb du chromosome III intacte. Lanes: Comme ci-dessus.

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<li>Muller, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-course+of+radiation-induced+chromosomal+aberrations+in+tumor+patients+after+radiotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Radiation+Oncology+Biol.+Phys%22%5BJournal%5D)">Time-course of radiation-induced chromosomal aberrations in tumor patients after radiotherapy.</a> Int. J. Radiation Oncology Biol. Phys. 63, 1214-1220 (2005).</li>
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</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Des doses élevées de rayonnements ionisants présentent un risque inhérent d&#39;instabilité du génome à travers la génération d&#39;un grand nombre de CDB 19. Les génomes eucaryotes sont remplis de séquences répétitives qui sont d&#39;excellents substrats pour générer des translocations et des réarrangements génomiques d&#39;autres 20,21. Translocations chromosomiques par les RH sont fréquemment observés lorsque CDB sont introduits entre les séquences répétitives 12,21,22. Des preuves irréfutables indiquent qu&#39;une grande partie de l&#39;instabilité génomique associée aux leucémies et les lymphomes peuvent être attribués à des translocations chromosomiques, en soulignant l&#39;importance de comprendre comment ce mécanisme se produit chez les eucaryotes 22,23. Nous avons développé un système de levure bourgeonnante pour examiner la formation de chromosomes translocation induite par l&#39;ORD RH entre les régions d&#39;homologie courts sur différents chromosomes qui sont similaires en taille aux éléments répétitifs dispersés à travers la levure et le génome humain. Dans le dosage, la translocation du substrat his3-Δ3 &#39;est situé sur une copie du chromosome XV. L&#39;autre allèle his3 (his3-Δ200) a une suppression ~ 1kb du promoteur HIS3 et séquence codante qui empêche cette séquence d&#39;être utilisé comme un modèle pour la réparation 24. Le substrat his3-Δ5 &#39;est situé sur le locus LEU2 sur une copie du chromosome III, avec l&#39;autre copie du chromosome III contenant une inaltéré LEU2 allèle (figure 1). Une cassette de galactose-inductible HO expression endonucléase marqués par KAN-MX a été insérée dans le locus du chromosome IV TRP1 (trp1:: GAL-HO-KAN-MX). Chaque substrat de translocation est flanqué d&#39;une séquence de reconnaissance endonucléase HO-qui peuvent être ciblés pour un clivage en induisant l&#39;expression du gène HO par l&#39;ajout de galactose dans le milieu. Après clivage de l&#39;endonucléase HO-induites à l&#39;his3-Δ3 et his3-Δ5 «substrats, les cellules peuvent utiliser efficacement les voies partagées courts de HIS3 homologie de séquence (311 pb ou 60 pb) pour réparer les chromosomes brisés par les RH, générant un chromosome translocation avec une intacte HIS3 allèle 12-14,25. Parce que les cellules-mères n&#39;ont pas une copie intacte du gène HIS3, ils sont incapables de croître sur son support. Seules les cellules qui ont subi l&#39;événement de translocation peut être sélectionnée pour le manque de moyens histidine. Par conséquent, la fréquence des translocations chromosomiques peuvent être calculés en divisant le nombre de colonies prototrophes histidine par le nombre total de cellules viables plaqué, déterminé par étalement sur YPD. L&#39;ADN génomique et les chromosomes intacts peut alors être isolé du représentant de ses colonies +, et la présence d&#39;un chromosome translocation vérifiées par la génomique du Sud et analyses par transfert de chromosomes. Une analyse minutieuse nous a permis de recueillir d&#39;autres informations importantes sur le dosage de 12. Genomic analyse de Southern a fourni la preuve qu&#39;il ya la coupe quasi complète des chromosomes XV et III, après 30 minutes de l&#39;endonucléase HO-induction, et donc il n&#39;ya pas de fond important des substrats bruts chromosomiques dans la population (G. &amp; A. Manthey Bailis, résultats non publiés). Genomic analyses par Southern blot et le chromosome de Sa - survivants indiquent que les cellules perdent souvent un, l&#39;autre, ou les deux chromosomes couper et rester viable (L. Liddell &amp; A. Bailis, résultats non publiés). Surtout, l&#39;efficacité plaquage près équivalente sur un milieu non sélectif avant et après l&#39;induction de l&#39;expression de HO-endonucléase indique que ni le défaut de réparation de chromosomes cassés, ni l&#39;incapacité à retenir les chromosomes translocation affecte la capacité de survivre à la formation de l&#39;ORD. Conformément à cela, le TXV: chromosome translocation III a été montré à être instable dans les cellules mitotiques en l&#39;absence de sélection. Cela a été démontré par la croissance TXV:: III contenant ses recombinants + nuit non sélective, le placage des colonies isolées sur des plaques non-sélectif, et le placage réplique sur un milieu sélectif manque histidine. Dix à 70% des colonies résultant de ces plaques avaient perdu la TXV:: chromosome translocation III (N. Pannunzio &amp; A. Bailis, résultats non publiés). La translocation des chromosomes générés par l&#39;exposition IR chez les humains présentent une instabilité similaire 26. Cela suggère que la formation de la translocation peut contribuer à des événements précoces dans la tumorigenèse en favorisant la perte d&#39;hétérozygotie. Deuxièmement, de nombreuses analyses génétiques et moléculaires suggèrent que l&#39;Afrique subsaharienne, un mécanisme efficace et obligatoirement non-conservatrice de ressources humaines, est le principal mécanisme de formation de la translocation par HR suite à la création simultanée de CDB sur les deux chromosomes 12,27,28. Ceci est la consistent avec la constatation que de fortes doses de résultat IR dans une densité de CDB suffisante pour créer des sauts de côté de multiples séquences répétitives dans le génome de la levure, et une fréquence élevée de la formation de la translocation par les RH. Ensemble, ces observations suggèrent que l&#39;effet oncogène de l&#39;exposition chez les humains IR peut, en partie, le résultat de la réparation des CDB par un mécanisme efficace de ressources humaines qui génère des translocations qui, par leur instabilité inhérente, de promouvoir des changements génétiques qui tumorigenèse lancement. Parce que le rayonnement est souvent utilisé pour traiter le cancer des réarrangements du génome, qui résultent de la réparation des CDB radio-induites peuvent contribuer à la génération des cancers secondaires qui surviennent fréquemment chez les patients. Ainsi, ce modèle peut nous aider à acquérir une meilleure compréhension des bases génétiques et moléculaires d&#39;une réponse clinique importante à un traitement IR.

la quantification et l&#39;analyse de la formation de ho-endonucléase stimulé par les translocations chromosomiques simple brin recuit dans saccharomyces cerevisiae</em

Quantitation and Analysis of the Formation of HO-Endonuclease Stimulated Chromosomal Translocations by Single-Strand Annealing in Saccharomyces cerevisiae

La variation génétique est souvent médiatisée par des réarrangements génomiques qui surgissent à travers l&#39;interaction entre les éléments dispersés répétitifs présents dans chaque génome eucaryote. Ce processus est un mécanisme important pour générer la diversité entre et au sein des organismes 1-3. Le génome humain est constitué d&#39;environ 40% des séquences répétitives d&#39;origine rétrotransposon, y compris une variété de lignes et Sines 4. Des événements de change entre ces éléments répétitifs peuvent conduire à des réarrangements génomiques, y compris les translocations, qui peuvent perturber le dosage génique et d&#39;expression qui peut entraîner des maladies auto-immunes et les maladies cardiovasculaires 5, ainsi que le cancer chez les humains 6-9. Échange entre les éléments répétitifs survient dans une variété de façons. Échange entre les séquences qui partagent parfaite (ou presque parfaite) homologie produit par un processus appelé recombinaison homologue (RH). En revanche, non homologue fin (NHEJ) utilise peu-ou-pas d&#39;homologie de séquence pour l&#39;échange de 10,11. Le but principal des ressources humaines, dans les cellules en mitose, est de réparer des cassures double brin (CDB) a généré de façon endogène par réplication de l&#39;ADN et les lésions oxydatives aberrants, ou par exposition aux rayonnements ionisants (RI), et d&#39;autres agents endommageant l&#39;ADN exogène. Dans l&#39;essai décrit ici, CSD sont simultanément créés en bordure substrats recombinaison à deux différents loci chromosomiques dans les cellules diploïdes par un galactose-inductible HO-endonucléase (figure 1). La réparation des chromosomes cassés génère des translocations chromosomiques par simple-brin de recuit (ASS), un processus où des séquences homologues adjacentes aux extrémités des chromosomes sont joint de manière covalente à la suite de recuit. L&#39;un des substrats, his3-Δ3 », contient un 3 &#39;tronquée HIS3 allèle et est situé sur une copie du chromosome XV au locus HIS3 natif. Le deuxième substrat, his3-Δ5 », est situé au niveau du locus LEU2 sur une copie du chromosome III, et contient un 5 &#39;tronquée HIS3 allèle. Les deux substrats sont flanqués d&#39;un site de reconnaissance endonucléase HO qui peuvent être ciblés pour l&#39;incision par HO-endonucléase. Les sites de reconnaissance endonucléase HO natif au locus MAT, sur les deux copies du chromosome III, ont été supprimés dans toutes les souches. Cela empêche l&#39;interaction entre les substrats de la recombinaison et d&#39;autres extrémités des chromosomes cassés d&#39;interférer dans le dosage. La KAN-MX-marqués galactose-inductible cassettes d&#39;expression HO endonucléase est introduite au niveau du locus TRP1 sur le chromosome IV. Les substrats part 311 pb ou 60 pb de la séquence de codage HIS3 qui peuvent être utilisées par la machine pour réparation par HR ASS. Les cellules qui utilisent ces supports à la réparation des chromosomes cassés par les RH constituent une intacte et un allèle HIS3 TXV:: III translocation chromosomique qui peut être sélectionné par la capacité à croître sur milieu dépourvu d&#39;histidine (figure 2A). La fréquence de translocation par HR est calculé en divisant le nombre de colonies prototrophes histidine qui se posent sur ​​le milieu sélectif par le nombre total de cellules viables qui surviennent après étalement des dilutions appropriées sur milieu non sélectif (figure 2B). Une variété de mutants de réparation d&#39;ADN ont été utilisés pour étudier le contrôle génétique de la formation de la translocation par SSA en utilisant ce système 12-14.

Le dosage de la translocation HO-stimulé surveille simple brin recuit après la création de l&#39;ADN des cassures double brin à des loci multiples diploïde<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;. Ce mécanisme peut modèle de réarrangements génomiques dans les cellules somatiques des eucaryotes supérieurs après une exposition à des doses élevées de rayonnements ionisants.

La quantification et l&#39;analyse de la formation de HO-endonucléase Stimulé par les translocations chromosomiques simple brin recuit dans Saccharomyces cerevisiae</em

La variation génétique est fréquemment médiée par des réarrangements génomiques qui résultent de l'interaction entre des éléments répétitifs dispersés présents dans chaque...

L'objectif général de cette procédure est de déterminer le contrôle génétique de la formation de translocations par appariement simple brin dans des cellules diploïdes de levure bourgeonnante. Cela est réalisé en premier lieu en inoculant des cultures avec des colonies isolées d'un génotype spécifique et en les faisant croître toute la nuit. La deuxième étape de la procédure consiste à induire la formation simultanée de cassures double brin par l'endonucléase Ho sur deux chromosomes, en ajoutant du galactose aux cultures.Les dilutions suivantes de ces cultures sont ensemencées sur des milieux sélectifs et non sélectifs. La dernière étape consiste à déterminer la fréquence de translocation en comptant les colonies apparaissant sur les milieux sélectifs et non sélectifs. En définitive, on peut obtenir des résultats montrant le contrôle génétique de la formation de translocations par brin simple, une modulation par des modifications de la fréquence de formation de translocations induites par ho chez des souches de génotypes différents.Les implications de cette technique s'étendent aux conséquences de l'exposition aux rayonnements thérapeutiques chez les patients atteints de cancer, car les cassures double brin de l'ADN et la formation de translocations sont les conséquences principales de ce traitement. Pour commencer la procédure de détermination des fréquences de translocation induites, ensemencer 10 à 20 cultures indépendantes d'un millilitre de milieu YPG (glycérol-lactate au tryptone-yeast) avec des colonies uniques du génotype souhaité, puis incuber les cultures toute la nuit à 30 degrés Celsius sur un agitateur rotatif. Lorsque les cultures ont atteint la densité cellulaire souhaitée, ajouter du galactose à 20 % aux cultures pour obtenir une concentration finale de 2 %. Le galactose induira l'expression de l'endonucléase Ho, qui provoquera des cassures double brin au niveau de l'allèle *his3-δ5’* sur le chromosome 3 et de l'allèle *his3-δ3’* sur le chromosome 15 ; incuber pendant quatre heures à 30 degrés Celsius sur un agitateur rotatif.L'étape suivante est cruciale pour la réussite de la procédure. Une dilution et une mise en boîte soigneuses des cultures sont impératives. Si vous obtenez des fréquences de translocation suffisamment reproductibles pour permettre des comparaisons statistiquement significatives entre souches de génotype différent, après quatre heures, ensemencez sur milieu dépourvu d'histidine ainsi que sur YPD des dilutions appropriées des cultures, en visant environ 100 à 200 colonies par boîte. Incubez les boîtes à 30 degrés Celsius pendant deux à trois jours.Lorsque des colonies apparaissent, on peut déterminer la fréquence de translocation. Les rendements de mise en culture avant et après l'induction de l'expression de l'endonucléase ho indiqueront si la présence ou l'absence de l'un ou l'autre des chromosomes de translocation affecte la capacité à survivre à la formation de cassures double-brin. Cela permet de fragmenter une copie de chacun des chromosomes trois et quinze afin de déterminer les rendements de mise en culture pré-induction.Tout d'abord, prélevez un aliquot de cellules de chaque culture réalisée pendant la nuit et déterminez le nombre de cellules en effectuant un décompte à l’aide d’un cytomètre sanguin. Ensuite, utilisez une dilution appropriée pour ensemencer environ 100 à 200 cellules sur du YPD et incubez pendant deux à trois jours à 30 degrés Celsius jusqu’à apparition des colonies. Ajoutez 20 % de galactose aux cultures restantes pour obtenir une concentration finale de 2 %, puis incubez à 30 degrés Celsius pendant quatre heures afin de déterminer l’efficacité de la mise en culture après induction.Prélève un aliquot de cellules de chaque culture après quatre heures d'induction et détermine le nombre de cellules à l'aide d'un hémocytomètre. Effectue une mise en plaque pour compter environ 100 à 200 cellules en utilisant une dilution appropriée sur YPD, puis incube pendant deux à trois jours à 30 degrés Celsius jusqu'à l'apparition des colonies. Une fois les colonies apparues sur les plaques, l'efficacité de la mise en plaque peut être déterminée. Les clones porteurs de translocation putative peuvent être analysés par transfert de Southern.Cette procédure utilise de l'ADN génomique préparé à partir d'une seule colonie recombinante « hiss » issue de chaque essai indépendant ; elle digère environ quatre microgrammes de chaque échantillon d'ADN avec l'endonucléase de restriction BAM H I, sépare les fragments digérés par BAM H I sur un gel d'agarose à 0,7 %, puis transfère ces fragments sur une membrane en nylon chargée positivement. L'hybridation s'effectue avec une sonde marquée au P 32 obtenue par amorçage aléatoire à partir d'un clone génomique BMH I de 1,8 KILOBASE contenant le gène HIS trois. Visualiser les fragments d'ADN par autoradiographie ou imagerie phosphorée. Une autre méthode pour analyser les clones porteurs d'une translocation présumée consiste à effectuer une analyse par caryotype chromosomique.Les chromosomes sont d'abord préparés à partir de recombinants hiss sélectionnés, puis séparés dans des bouchons d'agarose sur un gel d'agarose à 1 % dans un champ électrique homogène à champ pulsé orienté ou CHEF, à 14 degrés Celsius. Les paramètres suivants sont utilisés : premier bloc, 14 degrés Celsius, temps de commutation de 72 secondes et 15 heures à six volts par centimètre ; second bloc, 14 degrés Celsius, temps de commutation de 122 secondes et 11 heures à six volts par centimètre. À l'issue de l'électrophorèse, visualiser les chromosomes en colorant le gel avec du bromure d'ethidium pendant 30 minutes, puis en irradiant avec des UV et en faisant une décoloration, et transférer les chromosomes vers une membrane chargée positivement par action capillaire.En conditions dénaturantes, l'hybridation s'effectue avec une sonde marquée au P 32 obtenue par amorçage aléatoire à partir d'un clone génomique de 1,8 kilobase Bam H I contenant le gène hiss. Trois gènes permettent de visualiser les chromosomes par autoradiographie ou imagerie phospho. La fréquence des translocations chromosomiques peut être calculée en divisant le nombre de colonies phototrophes à l'histamine par le nombre total de cellules viables déterminé par ensemencement sur YPD.Dans cet exemple, la fréquence de recombinaison calculée est d'environ 3 %. Le test permettant de mesurer les fréquences de translocation induites peut être réalisé à l’aide de souches possédant différents génotypes, afin de comparer les différences de capacité à réparer les cassures double brin par brin simple. Un genou, tel qu’illustré sur ce graphique représentatif. Les fréquences de translocation obtenues, tant de manière sélective que non sélective, avec l’homozygote nul RAD 51 delta, étaient statistiquement différentes de celles obtenues dans les conditions correspondantes avec la souche sauvage, avant et après l’ensemencement post-induction.Les rendements sont déterminés en divisant le nombre total de cellules formant des colonies viables par le nombre total de cellules présentes en culture, déterminé par comptage au cytomètre sanguin, comme indiqué dans ce tableau avant et après l'ensemencement post-induction. Les rendements n'étaient pas significativement différents pour les cellules de type sauvage, ce qui suggère que la présence ou l'absence de l'un ou l'autre chromosome de translocation n'affecte pas la capacité à survivre. Formation de cassures simple brin (DSB).Les clones porteurs d'une translocation présumée peuvent être analysés par une analyse génomique par Southern blot. Une représentation schématique des chromosomes concernés avant et après la formation de la translocation est présentée ici. Les tailles des fragments de restriction contenant les séquences pertinentes, générés par la digestion BAM H one de l'ADN génomique provenant de souches parentales et recombinantes et révélés sur les blots par hybridation avec un fragment de 1,8 kilobase BAM H one, sont indiquées.Ses trois clones génomiques sont indiqués en paires de kilobases pour l'analyse par Southern blot. L'ADN génomique est digéré par l'endonucléase BMH1 et hybridé à une sonde de 1,8 kilobase marquée au P32. La sonde HIS3 permet de visualiser ces fragments diagnostiques.0,8 kilobase HIS trois delta 201,7 kilobase hiss trois delta trois prime 4 kilobase T 3 15 5 kilobase T 15 trois et huit kilobase hiss trois delta cinq prime fragments. La voie A est le diploïde parent. La voie B est un recombinant de translocation non réciproque hiss plus et la voie C est une translocation réciproque his plus.L'analyse recombinante du chromosome par BLO peut également être utilisée pour examiner les clones porteurs de translocations. Les chromosomes intacts, préparés dans des bouchons d'agarose, sont séparés par électrophorèse CHEF et le gel est coloré avec du bromure d'iridium puis visualisé sous lumière UV. Les chromosomes séparés sont ensuite transférés sur nylon et hybridés avec la sonde marquée au P32 de 1,8 kilobase.Ses trois sondes permettent de visualiser le chromosome entier de 1,1 mégabase du chromosome 15, le chromosome de translocation T15;3 de 15,8 mégabases, le chromosome de translocation T3;15 de 0,6 mégabase et le chromosome 3 entier de 0,3 mégabase. La piste A correspond au parent déployé. La piste B correspond à A his avec un recombinant de translocation non réciproque, et la piste C correspond à A his avec un recombinant de translocation réciproque.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de déterminer la fréquence de formation de translocations suite à plusieurs cassures double brin induites par une stimulation ho.

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