Imagerie par microscopie confocale d’arborescences dendritiques intactes et de la morphologie de la colonne vertébrale dans le cerveau d’une souris dégagée
JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurosciences
0 vues • 4:02 min • May 29th, 2025
Prenez un cerveau de souris nettoyé avec des cellules exprimant des protéines fluorescentes et des lipides supprimés pour plus de transparence pour une imagerie de structure profonde à haute résolution.
Un treillis d’hydrogel préserve les biomolécules et maintient les réseaux neuronaux.
Transférez le cerveau dans une chambre d’imagerie contenant un anneau d’agarose pour le support.
Fixez le tissu avec un adhésif et remplissez la chambre avec une solution d’adaptation de l’indice de réfraction pour minimiser la diffusion de la lumière et créer un environnement d’imagerie stable.
Placez la chambre sur une platine de microscope confocal et abaissez doucement l’objectif dans la solution pour établir une colonne de contact continue.
Utilisez l’épifluorescence pour localiser les régions d’intérêt. Ensuite, ajustez les paramètres du laser et de l’imagerie pour optimiser la qualité de l’image.
Capturez une série de piles z pour créer une représentation tridimensionnelle du tissu.
Utilisez un logiciel approprié pour analyser la morphologie cellulaire, y compris les arborescences dendritiques, leurs épines, ainsi que la distribution et la densité des neurones.
Pour construire une grande chambre d’imagerie tissulaire pour des tissus de plus de 5 millimètres d’épaisseur, utilisez une parabole en verre de 10 centimètres avec une paroi haute. Placez un tube conique de 50 millilitres au centre, en vous assurant que le diamètre du tube est suffisamment grand pour accepter le canon de l’objectif utilisé. Faites 3 % d’agarose dans de l’eau et versez-le dans l’espace entre le plat en verre et le tube conique.
Laissez ensuite refroidir pendant une heure. Cela formera un anneau d’agarose solide. Collez solidement le tissu au fond de la chambre à l’aide de superglue et remplissez la chambre d’une solution d’appariement de l’indice de réfraction, qui peut commencer à polymériser à moins d’être conservée à l’air libre et stockée à 4 degrés Celsius. Acquérez l’image à l’aide d’un microscope confocal.
Allumez tous les équipements d’imagerie appropriés. Placez l’échantillon sur la platine. Approchez soigneusement le support d’immersion avec l’objectif et formez une colonne continue de supports. À l’aide de l’épifluorescence, trouvez un champ d’imagerie approprié. Commencez par régler les paramètres de résolution et de vitesse de balayage.
Si vous effectuez une imagerie à l’aide d’un microscope confocal, fermez complètement le sténopé pour obtenir la plus petite section optique et donc la meilleure résolution Z. Augmentez progressivement la puissance du laser ou le gain du capteur jusqu’à obtenir une image appropriée avec un rapport signal/bruit élevé. Si vous utilisez l’imagerie bicolore EGFP standard ou tdTomato, réglez les paramètres de collecte de lumière.
Réglez les paramètres de la pile Z en fonction du début et des extrémités observés du tissu. Définissez la taille du pas en fonction de la résolution Z souhaitée. Des pas plus petits donneront une plus grande résolution Z, mais peuvent entraîner un blanchiment de l’échantillon.
Lorsque vous êtes satisfait des paramètres d’acquisition d’image, acquérez l’image. Assurez-vous que l’image a un rapport signal/bruit élevé et qu’elle montre des limites distinctes de structures.
Aperçu
Cet article décrit une méthode d'imagerie de cerveaux de souris clarifiés en utilisant la microscopie confocale. La technique permet une visualisation à haute résolution des réseaux neuronaux et de la morphologie cellulaire.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Techniques d'imagerie
- Biologie cellulaire
Contexte
- Les techniques de clarification améliorent la qualité de l'imagerie en éliminant les lipides.
- Les protéines fluorescentes permettent de visualiser des structures cellulaires spécifiques.
- Les réseaux d'hydrogel préservent les biomolécules pendant l'imagerie.
- La microscopie confocale fournit des images tridimensionnelles détaillées.
Objectif de l'étude
- Développer une méthode fiable pour l'imagerie de tissus cérébraux épais.
- Optimiser les paramètres d'imagerie pour une acquisition de données de haute qualité.
- Analyser la morphologie neuronale et les structures des réseaux.
Méthodes utilisées
- Préparation d'un cerveau de souris transparenté exprimant des protéines fluorescentes.
- Utilisation d'un réseau d'hydrogel pour maintenir l'intégrité tissulaire.
- Imagerie par microscopie confocale et épifluorescence.
- Analyse de la morphologie cellulaire à l'aide d'un logiciel spécialisé.
Résultats principaux
- Imagerie réussie des réseaux neuronaux dans des tissus cérébraux clarifiés.
- Acquisition de z-stacks haute résolution pour une analyse détaillée.
- Des paramètres d'imagerie optimisés ont permis d'obtenir des rapports signal sur bruit élevés.
- Mise en évidence de l'efficacité du montage avec anneau d'agarose pour les tissus épais.
Conclusions
- La méthode offre une approche robuste pour l'imagerie de structures cérébrales complexes.
- Une imagerie de haute qualité peut faciliter une meilleure compréhension des réseaux neuronaux.
- Les applications futures pourraient inclure l'étude de diverses affections neurologiques.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
L'imagerie confocale à haute résolution des arborisations dendritiques intactes et de la morphologie des épines dans des cerveaux de souris transparents permet une analyse quantitative de l'architecture neuronale essentielle à la découverte précoce de médicaments agissant sur le système nerveux central. Ce flux de travail soutient la déminution des risques mécanistiques et renforce la confiance prédictive dans la validation des cibles en fournissant un contexte cellulaire tridimensionnel détaillé. L'approche améliore la continuité translationnelle en reliant les découvertes moléculaires aux phénotypes complexes au niveau tissulaire.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- L'imagerie quantitative de la morphologie dendritique et des épines soutient la validation fonctionnelle des cibles en neurobiologie.
- La reconstruction tridimensionnelle permet de clarifier l'architecture des réseaux neuronaux pour une détection mécanistique des risques.
- La cartographie cellulaire détaillée renseigne la confiance prédictive dans le choix des cibles du SNC.
Développement de criblages et de tests
- La préparation de tissus déclarés et structurellement préservés permet des tests d'imagerie reproductibles.
- Des paramètres d'imagerie standardisés et l'acquisition de piles en z soutiennent l'extensibilité des tests et la réutilisation de la plateforme.
- Les résultats morphologiques quantitatifs facilitent une évaluation fiable des composés dans les criblages phénotypiques.
Recherche translationnelle et préclinique
- L'alignement de la morphologie cellulaire avec des modèles pertinents pour la maladie améliore le développement de biomarqueurs translationnels.
- La continuité entre la découverte moléculaire et la validation au niveau tissulaire soutient les décisions d'avancement ajustées au risque.
- Les ensembles de données tridimensionnelles permettent la comparaison entre modèles pour la validation préclinique.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Ce protocole d'imagerie confocale s'intègre de la phase initiale de découverte à la recherche préclinique, en soutenant les tests d'hypothèses, la validation des cibles et l'alignement des biomarqueurs translationnels dans les portefeuilles du SNC.
- Biologie de la découverte : Permet l'interrogation fondée sur des hypothèses de la structure et des connexions neuronales.
- Écrantage : Fournit des images quantitatives reproductibles pour le développement de tests.
- Analytique : Fournit des mesures morphologiques haute résolution destinées à l'analyse comparative.
- Recherche translationnelle : Facilite la corrélation entre les phénotypes cellulaires et les modèles de maladies.
- Réutilisation en entreprise : Met en place une plateforme d'imagerie standardisée, adaptable à divers programmes de recherche sur le SNC.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive et réduit l'ambiguïté mécanistique dans la validation des cibles du SNC.
- Valeur opérationnelle : Standardise les flux de travail d'imagerie pour assurer la reproductibilité et l'évolutivité.
- Valeur stratégique : Améliore les décisions d'aller/arrêt et l'efficacité du capital en permettant une analyse morphologique robuste.
- Impact sur le portefeuille : Favorise la priorisation et l'avancement ajustés au risque des programmes de découverte du SNC.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en microscopie confocale et en techniques de clarification tissulaire.
- Exige un accès à des systèmes d'imagerie haute résolution et à des logiciels d'analyse.
- Implique une standardisation interéquipes des paramètres d'imagerie et des protocoles d'analyse.
- Une adaptation peut être nécessaire selon les types de tissus ou les systèmes modèles.
- La décoloration des échantillons et les limitations de profondeur d'imagerie doivent être gérées pendant l'acquisition.
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Dernière mise à jour : 22 août 2026