Imagerie par microscopie confocale d’arborescences dendritiques intactes et de la morphologie de la colonne vertébrale dans le cerveau d’une souris dégagée

Prenez un cerveau de souris nettoyé avec des cellules exprimant des protéines fluorescentes et des lipides supprimés pour plus de transparence pour une imagerie de structure profonde à haute résolution.

Un treillis d’hydrogel préserve les biomolécules et maintient les réseaux neuronaux.

Transférez le cerveau dans une chambre d’imagerie contenant un anneau d’agarose pour le support.

Fixez le tissu avec un adhésif et remplissez la chambre avec une solution d’adaptation de l’indice de réfraction pour minimiser la diffusion de la lumière et créer un environnement d’imagerie stable.

Placez la chambre sur une platine de microscope confocal et abaissez doucement l’objectif dans la solution pour établir une colonne de contact continue.

Utilisez l’épifluorescence pour localiser les régions d’intérêt. Ensuite, ajustez les paramètres du laser et de l’imagerie pour optimiser la qualité de l’image.

Capturez une série de piles z pour créer une représentation tridimensionnelle du tissu.

Utilisez un logiciel approprié pour analyser la morphologie cellulaire, y compris les arborescences dendritiques, leurs épines, ainsi que la distribution et la densité des neurones.

Pour construire une grande chambre d’imagerie tissulaire pour des tissus de plus de 5 millimètres d’épaisseur, utilisez une parabole en verre de 10 centimètres avec une paroi haute. Placez un tube conique de 50 millilitres au centre, en vous assurant que le diamètre du tube est suffisamment grand pour accepter le canon de l’objectif utilisé. Faites 3 % d’agarose dans de l’eau et versez-le dans l’espace entre le plat en verre et le tube conique.

Laissez ensuite refroidir pendant une heure. Cela formera un anneau d’agarose solide. Collez solidement le tissu au fond de la chambre à l’aide de superglue et remplissez la chambre d’une solution d’appariement de l’indice de réfraction, qui peut commencer à polymériser à moins d’être conservée à l’air libre et stockée à 4 degrés Celsius. Acquérez l’image à l’aide d’un microscope confocal.

Allumez tous les équipements d’imagerie appropriés. Placez l’échantillon sur la platine. Approchez soigneusement le support d’immersion avec l’objectif et formez une colonne continue de supports. À l’aide de l’épifluorescence, trouvez un champ d’imagerie approprié. Commencez par régler les paramètres de résolution et de vitesse de balayage.

Si vous effectuez une imagerie à l’aide d’un microscope confocal, fermez complètement le sténopé pour obtenir la plus petite section optique et donc la meilleure résolution Z. Augmentez progressivement la puissance du laser ou le gain du capteur jusqu’à obtenir une image appropriée avec un rapport signal/bruit élevé. Si vous utilisez l’imagerie bicolore EGFP standard ou tdTomato, réglez les paramètres de collecte de lumière.

Réglez les paramètres de la pile Z en fonction du début et des extrémités observés du tissu. Définissez la taille du pas en fonction de la résolution Z souhaitée. Des pas plus petits donneront une plus grande résolution Z, mais peuvent entraîner un blanchiment de l’échantillon.

Lorsque vous êtes satisfait des paramètres d’acquisition d’image, acquérez l’image. Assurez-vous que l’image a un rapport signal/bruit élevé et qu’elle montre des limites distinctes de structures.