Utilisation de la réflectométrie spectrale pour déterminer les diamètres axonaux myélinisés dans une tranche de cerveau de souris fixe
JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurosciences
0 vues • 4:16 min • May 29th, 2025
Prenez un microscope confocal hyperspectral avec une source laser stabilisée configurée pour une large gamme spectrale afin de décoder la nanostructure de la gaine de myéline du tissu cérébral.
Utilisez un miroir de référence pour capturer le spectre de réflectance de base. Retirez le miroir et acquérez un spectre de décalage sombre pour la correction du bruit du détecteur.
Transférez une chambre avec une coupe de tissu cérébral fixe à la platine du microscope.
Alignez le plan focal sur la région tissulaire d’intérêt, en assurant une profondeur suffisante pour minimiser les interférences de l’interface verre-tissu.
La lumière laser est dirigée sur la gaine de myéline multicouche des axones.
Lorsque la lumière interagit avec la myéline, des réflexions partielles se produisent aux interfaces des couches, produisant des motifs d’interférence dus à des épaisseurs de couche variables et à des indices de réfraction.
Acquérir des images spectrales de ces modèles d’interférence.
Après correction de la ligne de base et analyse du signal, le spectre de réflectance révèle la périodicité du numéro d’onde, ce qui permet de déterminer les diamètres des axones myélinisés.
Montez un miroir de référence sur la platine du microscope, la surface faisant face à la lentille de l’objectif. S’il n’est pas facile de placer le miroir sur la platine du microscope, collez un miroir sur la plaque plane. Ajustez la platine du microscope pour aligner le plan focal sur la surface du miroir. Ensuite, ajustez le gain PMT et la puissance laser, en tenant compte de la plage dynamique du détecteur.
Sous une pseudo-couleur, vérifiez qu’il n’y a pas de saturation sur toute la gamme de longueurs d’onde. Si une saturation est observée, réduisez la puissance du laser. Ensuite, exécutez l’acquisition de l’analyse lambda. Retirez le miroir de la platine, et répétez la même acquisition sans échantillon afin d’obtenir la référence sombre. Ensuite, enregistrez les données dans un format TIFF à plusieurs piles.
Pour effectuer l’acquisition d’images SpeRe, placez le tissu monté sur la platine du microscope. Pour aligner grossièrement le tissu sur le plan focal de la lentille de l’objectif, à travers un oculaire, utilisez le mode de fluorescence à grand champ. Avec le balayage en direct activé, contrôlez la platine du microscope pour aligner le plan focal sur la région d’intérêt dans le tissu. Pour éviter le bruit de fond de la lamelle, sélectionnez une région cible d’au moins 15 micromètres de profondeur à partir de l’interface du tissu de verre.
Acquérez la pile d’images spectrales pour la région cible en utilisant la même procédure que celle illustrée précédemment dans cette vidéo. Ensuite, enregistrez les données du tissu et du décalage sombre au format TIFF multi-empilé. Pour traiter les images dans ImageJ, ouvrez les données spectrales du miroir de référence et du tissu cérébral.
Sélectionnez les zones d’intérêt pour les piles d’images ouvertes, la zone centrale pour le miroir de référence et le segment d’une fibre axonale pour le tissu cérébral. Ensuite, exécutez image, empilez, tracez le profil de l’axe z pour acquérir les spectres bruts pour les ROI sélectionnés.
Les fibres axonales peuvent être structurellement hétérogènes sur toute leur longueur, il est donc recommandé de sélectionner le retour sur investissement sur un petit segment axonal, généralement inférieur à 5 micromètres, pour minimiser les artefacts de volume partiel.
Ouvrez les données de décalage sombre, l’une prise pour le miroir de référence et l’autre pour le tissu cérébral, et tracez le profil de l’axe z comme cela vient d’être démontré. Ensuite, utilisez les options copier-coller pour enregistrer toutes les options acquises.
Aperçu
Cet article démontre l'utilisation de la microscopie réflectométrique spectrale (SpeRe) avec un microscope confocal hyperspectral pour analyser la nanostructure des axones myélinisés dans des tranches de tissu cérébral fixé. En capturant et en analysant les motifs d'interférence générés par la gaine de myéline multicouche, les chercheurs peuvent déterminer les diamètres des axones avec une grande précision.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Microscopie
- Imagerie optique
Contexte
- Les axones myélinisés sont essentiels à la transmission rapide des signaux dans le système nerveux.
- Les méthodes traditionnelles de mesure du diamètre des axones peuvent être invasives ou manquer de résolution nanométrique.
- Les motifs d'interférence optique provenant des gaines de myéline multicouches offrent un moyen non destructif d'évaluer la structure axonale.
- La microscopie confocale hyperspectrale permet une analyse spectrale détaillée des tissus biologiques.
Objectif de l'étude
- Démontrer un protocole utilisant la réflectométrie spectrale pour analyser les axones myélinisés in situ.
- Proposer une méthode permettant de déterminer avec précision le diamètre des axones dans des tranches de tissu cérébral fixé.
- Présenter l'application de la microscopie confocale hyperspectrale à la recherche en neurobiologie.
Méthodes utilisées
- Préparation de coupes de tissu cérébral fixé pour l'imagerie.
- Utilisation d'un microscope confocal hyperspectral doté d'une source laser stabilisée couvrant un large domaine spectral.
- Acquisition de spectres de réflectance de base à l'aide d'un miroir de référence et de spectres de décalage noir pour la correction du bruit.
- Alignement du plan focal sur la région du tissu d'intérêt, en assurant une profondeur suffisante par rapport à l'interface verre-tissu.
- Acquisition de piles d'images spectrales provenant des axones myélinisés et des régions de référence.
- Traitement des images et analyse spectrale à l'aide d'ImageJ pour extraire les spectres de réflectance et déterminer les diamètres des axones.
Résultats principaux
- Des motifs d'interférence générés par la gaine de myéline ont été correctement capturés à l'aide de la réflectométrie spectrale.
- Des corrections du niveau de base et du décalage sombre ont permis des mesures spectrales précises.
- L'analyse du spectre de réflectance a révélé une périodicité en nombre d'onde correspondant au diamètre de l'axone.
- La sélection de petites régions d'intérêt a minimisé les artefacts dus à l'hétérogénéité axonale.
Conclusions
- La microscopie réflectométrique spectrale fournit une méthode non destructive et à haute résolution pour analyser in situ la structure des axones myélinisés.
- Le protocole permet une mesure précise du diamètre des axones dans un tissu cérébral fixé.
- Cette approche peut faciliter des études avancées de la microstructure neuronale et des pathologies liées à la myéline.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
La mesure quantitative des diamètres des axones myélinisés à l'aide de la réflectométrie spectrale permet une analyse structurelle à haute résolution, essentielle pour la découverte de médicaments axée sur la neurobiologie. Cette approche renforce la confiance prédictive dans la validation des cibles et la réduction des risques mécanistiques pour les actifs du portefeuille du SNC. L'intégration de métriques axonales précises dans les flux de travail de la phase initiale de découverte améliore la continuité translationnelle et la prise de décision ajustée au risque.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Permet une analyse quantitative de la microstructure neuronale pertinente pour les modèles de maladies.
- Facilite la réduction des risques mécanistiques en fournissant des mesures directes de l'architecture de la gaine de myéline.
- Permet une validation fiable des cibles thérapeutiques pour les voies liées à la myéline et les affections neurodégénératives.
Développement de tests et criblage
- Prépare des systèmes de tissu cérébral validés pour le criblage de composés en aval.
- Fournit des résultats reproductibles et quantitatifs pour l'évaluation du diamètre des axones.
- Permet la standardisation des tests et la réutilisation de plateformes dans les flux de travail en neurobiologie.
Recherche translationnelle et préclinique
- Aligne les données structurales avec des biomarqueurs pertinents pour la maladie dans les études translationnelles.
- Permet une continuité allant de la découverte à la validation préclinique dans les programmes du SNC.
- Offre une valeur prédictive pour l'intégrité de la myéline dans les modèles précliniques.
Intégration du pipeline et du flux de travail
La mesure des axones par réflectométrie spectrale s'inscrit dans le continuum allant de la découverte précoce à la phase préclinique, en soutenant à la fois la vérification d'hypothèses et l'alignement de biomarqueurs translationnels.
- Biologie de la découverte : Fournit des données structurales quantitatives pour la validation ciblée fondée sur des hypothèses.
- Écrantage : Propose des mesures reproductibles et standardisées pour le développement de tests.
- Analytique : Génère des profils spectraux permettant la comparaison directe des caractéristiques axonales entre différentes conditions.
- Recherche translationnelle : Relie les découvertes fondamentales aux stratégies précliniques de biomarqueurs en recherche sur le système nerveux central.
- Réutilisation institutionnelle : Met en place une capacité d'imagerie et d'analyse réutilisable pour les portefeuilles en neurobiologie.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Augmente la confiance prédictive et réduit l'ambiguïté mécanistique dans la validation des cibles du SNC.
- Valeur opérationnelle : Standardise la mesure des axones à haute résolution pour des flux de travail évolutifs.
- Valeur stratégique : Améliore les décisions d'aller/arrêt et l'efficacité du capital dans les programmes de neurobiologie.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque des actifs du SNC fondée sur des critères structuraux quantitatifs.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en microscopie confocale hyperspectrale et en analyse spectrale.
- Suppose l'accès à des sources laser stabilisées et à une infrastructure d'imagerie avancée.
- Exige une standardisation interéquipes de l'acquisition d'images et du choix des régions d'intérêt (ROI).
- L'adaptation à différents types de tissus peut nécessiter une optimisation du protocole pour la profondeur et la correction du fond.
- Les artefacts de volume partiel et l'hétérogénéité tissulaire doivent être gérés par une sélection rigoureuse des régions d'intérêt (ROI).
F.A.Q. sur la bio-industrie pharmaceutique
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Dernière mise à jour : 29 août 2026