Utilisation de la réflectométrie spectrale pour déterminer les diamètres axonaux myélinisés dans une tranche de cerveau de souris fixe

Prenez un microscope confocal hyperspectral avec une source laser stabilisée configurée pour une large gamme spectrale afin de décoder la nanostructure de la gaine de myéline du tissu cérébral.

Utilisez un miroir de référence pour capturer le spectre de réflectance de base. Retirez le miroir et acquérez un spectre de décalage sombre pour la correction du bruit du détecteur.

Transférez une chambre avec une coupe de tissu cérébral fixe à la platine du microscope.

Alignez le plan focal sur la région tissulaire d’intérêt, en assurant une profondeur suffisante pour minimiser les interférences de l’interface verre-tissu.

La lumière laser est dirigée sur la gaine de myéline multicouche des axones.

Lorsque la lumière interagit avec la myéline, des réflexions partielles se produisent aux interfaces des couches, produisant des motifs d’interférence dus à des épaisseurs de couche variables et à des indices de réfraction.

Acquérir des images spectrales de ces modèles d’interférence.

Après correction de la ligne de base et analyse du signal, le spectre de réflectance révèle la périodicité du numéro d’onde, ce qui permet de déterminer les diamètres des axones myélinisés.

Montez un miroir de référence sur la platine du microscope, la surface faisant face à la lentille de l’objectif. S’il n’est pas facile de placer le miroir sur la platine du microscope, collez un miroir sur la plaque plane. Ajustez la platine du microscope pour aligner le plan focal sur la surface du miroir. Ensuite, ajustez le gain PMT et la puissance laser, en tenant compte de la plage dynamique du détecteur.

Sous une pseudo-couleur, vérifiez qu’il n’y a pas de saturation sur toute la gamme de longueurs d’onde. Si une saturation est observée, réduisez la puissance du laser. Ensuite, exécutez l’acquisition de l’analyse lambda. Retirez le miroir de la platine, et répétez la même acquisition sans échantillon afin d’obtenir la référence sombre. Ensuite, enregistrez les données dans un format TIFF à plusieurs piles.

Pour effectuer l’acquisition d’images SpeRe, placez le tissu monté sur la platine du microscope. Pour aligner grossièrement le tissu sur le plan focal de la lentille de l’objectif, à travers un oculaire, utilisez le mode de fluorescence à grand champ. Avec le balayage en direct activé, contrôlez la platine du microscope pour aligner le plan focal sur la région d’intérêt dans le tissu. Pour éviter le bruit de fond de la lamelle, sélectionnez une région cible d’au moins 15 micromètres de profondeur à partir de l’interface du tissu de verre.

Acquérez la pile d’images spectrales pour la région cible en utilisant la même procédure que celle illustrée précédemment dans cette vidéo. Ensuite, enregistrez les données du tissu et du décalage sombre au format TIFF multi-empilé. Pour traiter les images dans ImageJ, ouvrez les données spectrales du miroir de référence et du tissu cérébral.

Sélectionnez les zones d’intérêt pour les piles d’images ouvertes, la zone centrale pour le miroir de référence et le segment d’une fibre axonale pour le tissu cérébral. Ensuite, exécutez image, empilez, tracez le profil de l’axe z pour acquérir les spectres bruts pour les ROI sélectionnés.

Les fibres axonales peuvent être structurellement hétérogènes sur toute leur longueur, il est donc recommandé de sélectionner le retour sur investissement sur un petit segment axonal, généralement inférieur à 5 micromètres, pour minimiser les artefacts de volume partiel.

Ouvrez les données de décalage sombre, l’une prise pour le miroir de référence et l’autre pour le tissu cérébral, et tracez le profil de l’axe z comme cela vient d’être démontré. Ensuite, utilisez les options copier-coller pour enregistrer toutes les options acquises.