Name: Cryoconservation dembryons de souris par base déthylène glycol vitrification (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-18T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min
Description: Apprenez la cryoconservation d'embryons de souris par vitrification au glycol d'éthylène. Cette méthode simple offre des taux de survie supérieurs à 90% et minimise la toxicité embryonnaire pour diverses souches.

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Cette étude a été menée en collaboration avec le Projet national de bioressources, le Ministère de l&#39;Education, Culture, Sports, Science et Technologie, Japon.

Le schéma global de l'expérience est montré dans la Fig. 1. 1. Préparation des réactifs <ol><li> Rendre le milieu de base (ici en tant que connue PB1) dans une bouteille de verre de 100 ml selon le tableau ci-dessous: <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> MW </td><td> mM </td><td> mg/100ml </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 58,4 </td><td> 136,98 </td><td> 800,0 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 74,6 </td><td> 2,68 </td><td> 20,0 </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> 136,1 </td><td> 1,47 </td><td> 20,0 </td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 0,12 H 2 O </td><td> 358,14 </td><td> 8,04 </td><td> 288,1 </td></tr><tr><td> MgCl 2, 6H 2 O </td><td> 203,3 </td><td> 0,49 </td><td> 10,0 </td></tr><tr><td glucose></td><td> 180,2 </td><td> 5,56 </td><td> 100,0 </td></tr><tr><td> Pyruvate de Na </td><td> 110 </td><td> 0,33 </td><td> 3.6 </td></tr><tr><td> CaCl 2, 2H 2 O </td><td> 147 </td><td> 0.9 </td><td> 13,2 </td></tr><tr><td> La pénicilline G </td><td></td><td></td><td> 6,0 (environ) </td></tr></tbody></table></li><li> Faites le Ficoll-sucrose (FS) solution: <ol><li> Ajouter les substances chimiques suivantes à 14 ml de PB1 solution dans un tube de 50 ml. <table border="1"><tbody><tr><td> Ficoll 70 </td><td> 6,0 g </td></tr><tr><td> Saccharose </td><td> 3,424 g </td></tr><tr><td> BSA </td><td> 42,0 mg </td></tr></tbody></table></li><li> Mélanger Ficoll 70 et du saccharose dans PB1 solution et bien agiter jusqu'à dissolution complète. </li><li> Après vérification de la dissolution complète ci-dessus, ajouter la BSA sur la surface de la solution et le conserver à4oC jusqu'à ce BSA est complètement dissous (&gt; 4 heures ou jusqu'au lendemain). </li></ol></li><li> Faire la solution d'équilibrage (EFS20) et la solution de vitrification (EFS40) dans un tube de 50 ml: <ul><li> EFS20: 20% (v / v) d'éthylène glycol, 24% (p / v) de Ficoll, et de 0,4 mol / L de saccharose dans PB1 avec BSA </li><li> EFS40: 40% (v / v) d'éthylène glycol, 18% (p / v) de Ficoll, et de 0,3 mol / L de saccharose * en PB1 avec BSA * Pour les embryons de la souche BALB / c ou ICR, augmenter la concentration de saccharose à 0,9 mol / L de saccharose, car ils sont plus sensibles aux cryodamage 6. </li></ul><table border="1"><tbody><tr><td></td><td> EFS20 solution </td><td> EFS40 solution </td></tr><tr><td> L'éthylène glycol </td><td> 1 ml </td><td> 2 ml </td></tr><tr><td> Solution de FS </td><td> 4 ml </td><td> 3 ml </td></tr></tbody></table></li><li> Stériliser la solution par filtration en utilisant une filte 0,45 umR. Faire aliquotes dans des tubes de 5 ml en polystyrène et conserver à 4 ° C. Ils peuvent être utilisés pendant environ 6 mois. </li><li> Préparation de la solution d'embryon dégel contenant 0,75 M de saccharose (TS1) <ol><li> Dissoudre 7,7 g de saccharose dans PB1 (préparé à l'étape 1.1) et porter le volume total à 30 ml. Mélanger en secouant doucement jusqu'à complète dissolution du saccharose. </li><li> Ajoutez 90 mg de BSA sur la surface de la solution et laisser reposer jusqu'à dissolution complète. </li><li> Stériliser la solution par filtration. </li><li> Aliquoter et conserver à 4 ° C. Ils peuvent être utilisés pendant environ un mois. </li></ol> Note: TS1 peuvent également être préparés à partir de M2 ​​disponibles commercialement. <ol start="6"><li> Dissoudre 7,7 g de saccharose dans M2 et porter le volume total à 30 ml. </li><li> Mélanger en secouant doucement jusqu'à complète dissolution du saccharose. </li><li> Stériliser la solution par filtration. </li><li> Aliquoter et stocker à 4 ° C. Ils peuvent être utilisés pendant environ un mois. </li></ol></li><li> TS2 (solution dégelcontenant 0,25 M de saccharose): <ol><li> Diluer 10 ml avec 20 volumes TS1 ml de PB1 ou M2, le cas échéant. </li><li> Aliquoter et conserver à 4 ° C. Ils peuvent être utilisés pendant environ un mois. </li></ol></li></ol> 2. La vitrification d'embryons de souris à 2 cellules <ol><li> Préparer deux cellules d'embryons de souris par accouplement naturel ou conventionnel dans les techniques de fécondation in vitro. </li><li> Aliquote de 50 ul EFS40 dans un cryotube. Ci-après, exécuter le reste de la procédure de vitrification à la température ambiante. </li><li> Aliquote de 50 pl d'EFS20 sur le fond de 35 mm ou 60 mm en plastique plat de Pétri. </li><li> Transfert jusqu'à 30 embryons à l'aide d'un EFS20 capillaire en verre avec seulement le montant minimum du milieu de culture. Démarrer une minuterie pendant 2 min. Remarque: les embryons Placer sur le fond de la goutte. Cela rend efficacité de la déshydratation des embryons. Vérifiez la morphologie des embryons par un stéréomicroscope. Embryons déshydratés montrent une morphologie ratatinée, comme indiqué dans la Fig. 2A.Si elles ne sont pas déshydratés assez d'attendre pour plus d'1 ou 2 min. </li><li> À environ 1,5 min, ramasser les embryons dans le menu déroulant EFS20 avec seulement le montant minimum de la solution. Transférez-les dans le cryotube EFS40 préparé en 2,1 étapes. Note: Pour les meilleurs résultats, ajuster le calendrier de ramasser des embryons de telle sorte que tous les embryons peuvent être transférés dans EFS40 à environ 2 min. </li><li> Attendre 1 min. </li><li> Mettez le cryotube directement dans l'azote liquide (LN2). </li></ol> 3. La décongélation des embryons de souris vitrifié 2-cellules <ol><li> Avant de décongélation, préparer un plat avec 10 gouttes ul de milieu de culture embryonnaire des embryons récupérés (voir l'étape 3.13). Couvrir le plat avec de l'huile et placer dans un incubateur à CO 2 jusqu'à son utilisation. Note: Bien que tous les médias pour la culture d'embryons de routine peuvent être utilisées dans cette expérience, nous recommandons médias avec plus osmolarité tel que le milieu M16. </li><li> TS1 chaud à 37 ° C. </li><li> Mettez un masque visage et cryogloves. Ouvrez la LN 2 tank et récupérer un cryotube contenant des embryons. </li><li> Ouvrir rapidement le haut du tube et jeter LN 2. Attendre 30 secondes pour éviter le gel des TS1 à l'étape suivante. </li><li> Utiliser une pipette 1000ul d'ajouter 850 l de TS1 (37 ° C) dans le tube et mélanger la solution par pipetages douce (environ dix fois en 25 secondes) jusqu'à ce que la solution est uniformément dissoute. </li><li> Transférer la totalité du volume du tube pour un plat en plastique de 60 mm de Pétri (ou un verre de montre) (figure 3A). Remarque: Les embryons doivent être manipulés à la température ambiante (22-25 ° C) jusqu'à ce qu'ils soient placés dans un incubateur à CO 2 à l'étape 3.14. </li><li> Démarrer une minuterie pendant 3 min. </li><li> A environ 2 min dans TS1, secouez doucement la parabole jusqu'à le milieu contenant les embryons est étalé sur la surface de la parabole (figure 3B). Note: Ceci aidera les embryons vont vers le bas parce qu'ils sont flottants près de la surface lors de son transfert à TS1. </li><li> Mettez trois gouttes de 50 pl d'TS2 sur ee plat (figure 3C). </li><li> Après 3 min dans TS1, vérifier la morphologie des embryons par un stéréomicroscope, ils devraient être légèrement rétrécie. Voir la morphologie des embryons en plus tôt (figure 2B) et plus tard (figure 2C) en TS1. Remarque: Si les embryons sont encore gonflées, les garder dans TS1 pour plus de 1 à 3 min. </li><li> Ramassez les embryons et les transférer à la première goutte de TS2 (Fig. 3D). Démarrer une minuterie pendant 3 min </li><li> Après 3 minutes, le transfert des embryons à la baisse de secondes, puis à la troisième baisse (Fig. 3E). </li><li> Transfert des embryons dans le milieu de culture préparé à l'étape 3.1. Les embryons sont dans la forme représentée dans la Fig. 2D. </li><li> Placez-vaisselle dans un incubateur à CO 2. Environ 10 minutes plus tard, le transfert des embryons à la baisse prochaine du milieu de culture pour laver le saccharose qui a été reporté de TS2. </li><li> Poursuivre la culture dans un incubateur à CO2 jusqu'au transfert d'embryon. Remarque: Le transfert EmbryOS pour les oviductes des femelles receveuses au jour de décongélation. Longue culture in vitro peut diminuer la viabilité des embryons chez certaines souches de souris. </li></ol> 4. Les résultats représentatifs: In vitro - et in vivo-développement des embryons après décongélation est présenté dans les tableaux 1 et 2. Les avantages de ce protocole sont les chances de survie élevé d'embryons après décongélation et son large applicabilité à différentes souches de souris. <table border="1"><tbody><tr><td> Souche </td><td> Nombre total de tubes </td><td> No. d'embryons vitrifiés </td><td> Réformé (n ° (%)) </td><td> Morphologiquement normaux (n ° (%)) </td><td> Développement d'blastocystes (n ° (%)) </td></tr><tr><td> C57BL/6J </td><td> 20 </td><td> 400 </td><td> 397 (99) </td><td> 394 (99) </td><td> 342 (87) </td></tr><tr><td> BALB / ca </td><td> 15 </td><td> 300 </td><td> 296 (99) </td><td> 282 (95) </td><td> 238 (84) </td></tr><tr><td> ICR </td><td> 24 </td><td> 480 </td><td> 474 (99) </td><td> 443 (93) </td><td> 398 (90) </td></tr></tbody></table> Tableau 1. In vitro-développement de vitrifiés et décongelés embryons dans des souches de souris commune <table border="1"><tbody><tr><td> Condition d'embryons </td><td> Nombre de femelles receveuses </td><td> No. d'embryons transférés </td><td> Sites d'implantation (n ° (%)) </td><td> Des jeunes vivants (n ° (%)) </td></tr><tr><td> Fraîches </td><td> 12 </td><td> 180 </td><td> 141 (78.3) </td><td> 110 (61.1) </td></tr><tr><td> Vitrifié </td><td> 16 </td><td> 242 </td><td> 202 (83.5) </td><td> 125 (51.7) </td></tr></tbody></table> Tableau 2. In vivo, le développement des vitrifiés et décongelés embryons chez des souris C57BL/6J. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3155/3155fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Le schéma d'ensemble de l'expérience, y compris l'équilibration, la vitrification, et la décongélation des embryons. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3155/3155fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. La morphologie des embryons à chaque étape de décongélation. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3155/3155fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> Figure 3. Dégel procédure d'embryons. Toutes les procédures sont réalisées à température ambiante. (A), ajouter 850 l de TS1 (37 ° C) dans un cryotube et le transfert de la totalité du volume de la solution dans le cryotube sur un plat en plastique. A cette époque, les embryons chercher gonflées comme indiqué dans la Fig. 2B. (B), étaler la solution sur la surface du plat en le secouant doucement. (C), 50 gouttes Placer trois pl d'TS2 sur le plat en plastique. (D), le transfert des embryons pour la première goutte de TS2. Après 3 minutes, les embryons chercher shurunken comme indiqué dans la Fig. 2C. (E), les transférer sériement dans le reste TS2 gouttes et puis au milieu de culture.

<ol><li>Whittingham, D. G., Leibo, S. P., Mazur, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+of+mouse+embryos+frozen+to+-196%C2%B0+and+-269%C2%B0C%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Survival of mouse embryos frozen to -196° and -269°C.</a> Science. 187, 411-414 (1972).</li>
<li>Rall, W. F., Fahy, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ice-free+cryopreservation+of+mouse+embryos+at+-196%C2%B0C+by+vitrification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ice-free cryopreservation of mouse embryos at -196°C by vitrification.</a> Nature. 313, 573-575 (1985).</li>
<li>Yoshiki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+resources+at+the+RIKEN+BioResource+center%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Anim%22%5BJournal%5D)">The mouse resources at the RIKEN BioResource center.</a> Exp. Anim. 58, 85-96 (2009).</li>
<li>Mochida, K., Ogura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+embryos+in+laboratory+species%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mamm.+Ova.+Res%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of embryos in laboratory species.</a> J. Mamm. Ova. Res. 27, 87-92 (2010).</li>
<li>Kasai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+mouse+embryos+cryopreservation+in+a+low+toxicity+vitrification+solution%2C+without+appreciable+loss+of+viability%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Reprod.+Fert%22%5BJournal%5D)">A simple method for mouse embryos cryopreservation in a low toxicity vitrification solution, without appreciable loss of viability.</a> J. Reprod. Fert. 89, 91-97 (1990).</li>
<li>Dinnyes, A., Wallace, G. A., Rall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+genotype+on+the+efficiency+of+mouse+embryo+cryopreservation+by+vitrification+or+slow+freezing+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Reprod.+Dev%22%5BJournal%5D)">Effect of genotype on the efficiency of mouse embryo cryopreservation by vitrification or slow freezing methods.</a> Mol. Reprod. Dev. 40, 429-435 (1995).</li>
<li>Kasai, M., Mukaida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+animal+and+human+embryos+by+vitrification%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod.+Biomed.+Online%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of animal and human embryos by vitrification.</a> Reprod. Biomed. Online. 9, 164-170 (2004).</li>
<li>Miyake, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitrification+of+mouse+oocytes+and+embryos+at+various+stages+of+development+in+an+ethylene+glycol-based+solution+by+a+simple+method%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Vitrification of mouse oocytes and embryos at various stages of development in an ethylene glycol-based solution by a simple method.</a> Theriogenology. 40, 121-134 (1993).</li>
<li>Han, M. S., Niwa, K., Kasai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitrification+of+rat+embryos+at+various+developmental+stages%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Vitrification of rat embryos at various developmental stages.</a> Theriogenology. 59, 1851-1863 (2003).</li>
<li>Jin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Equilibrium+vitrification+of+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Equilibrium vitrification of mouse embryos.</a> Biol. Reprod. 82, 444-450 (2010).</li>
</ol>

Nous n&#39;avons rien à révéler.

Depuis le premier rapport de la vitrification des embryons de souris par Rall et Fahy, en 1985, 2, plusieurs améliorations techniques ont été faits pour accroître la capacité de survie des embryons après décongélation. Une des modifications les plus réussies a été atteint par l&#39;utilisation de l&#39;éthylène glycol comme un cryoprotecteur en raison de sa faible toxicité et de haute perméabilité membranaire. Ces avantages nous permettent de gérer la congélation d&#39;embryons à 4 température ambiante; méthodes de vitrification d&#39;embryons d&#39;autres nécessitent la remise à des températures plus fraîches et ne sont pas toujours applicables à certaines souches de souris dont BALB / c 6. Vitrification à base de glycol d&#39;éthylène Le premier a été développé par Kasai et al. en 1990 5,7. Parce que la méthode originale a été optimisé pour les pailles en plastique comme les conteneurs, nous avons légèrement modifié le protocole pour cryotubes, qui sont plus facilement accessibles dans les laboratoires et les plus résistants aux dommages physiques. Par conséquent, la méthode de vitrification décrites ici peuvent être applicable à plusieurs laboratoires utilisant des souris comme modèles de recherche. La même méthode peut également être utilisé pour les embryons de souris à la morula et blastocyste étapes 8 et 9 embryons de rat. Toutefois, nous avons récemment constaté que la qualité des cryotubes peuvent affecter le taux de survie des embryons après congélation-décongélation. Ainsi, il est essentiel d&#39;examiner la surface intérieure de la cryotubes pour sa finesse, avant vitrification des embryons (par exemple, voir au tableau des réactifs spécifiques et les équipements). Méthodes de vitrification ont de nombreux avantages sur les méthodes classiques de congélation lente, mais ils ont intrinsèquement un désavantage par rapport à fin de transport. Comme embryons vitrifiés devrait être maintenu au-dessous de -120 ° C pour maintenir leur viabilité, les expéditeurs secs sont généralement utilisés pour leur transport sécuritaire. Expéditeurs à sec sont lourds et encombrants, et de leur voyage aller-retour coûte cher, surtout pour le transport international. Nous sommes maintenant en train de développer une nouvelle méthode de vitrification pardont les embryons vitrifiés peut être conservé à la température de la glace sèche (environ -80 ° C) pendant au moins 7 jours 10. Cette méthode devrait être la vitrification de la prochaine génération.

<table border="1"><tr><td> Nom du réactif </td><td> Société </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires (optionnel) </td></tr><tr><td> L&#39;albumine sérique bovine </td><td> Merck Biosciences (Calbiochem) </td><td> 12657 </td><td></td></tr><tr><td> L&#39;éthylène glycol </td><td> Wako Pure Chemical Industries </td><td> 058-00986 </td><td></td></tr><tr><td> Ficoll 70 </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0310-10 </td><td></td></tr><tr><td> Le glucose </td><td> Wako Pure Chemical Industries </td><td> 041-00595 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Wako Pure Chemical Industries </td><td> 191-01665 </td><td></td></tr><tr><td> KCl </td><td> Wako Pure Chemical Industries </td><td> 163-03545 </td><td></td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> Wako Pure Chemical Industries </td><td> 169-04245 </td><td></td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 · 12H 2 </sub&gt; O </td><td> Wako Pure Chemical Industries </td><td> 500-04195 </td><td></td></tr><tr><td> MgCl 2 · 6H 2 O </td><td> Wako Pure Chemical Industries </td><td> 135-00165 </td><td></td></tr><tr><td> CaCl2 · 2H2O </td><td> Wako Pure Chemical Industries </td><td> 031-00435 </td><td></td></tr><tr><td> La pénicilline G </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P-4687 </td><td></td></tr><tr><td> Pyruvate de sodium </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P-8574 </td><td></td></tr><tr><td> Saccharose </td><td> Wako Pure Chemical Industries </td><td> 196-00015 </td><td></td></tr><tr><td> M16 moyennes </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M7292 </td><td></td></tr><tr><td> Milieu M2 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M7167 </td><td></td></tr><tr><td> Cryotube </td><td> Sumitomo Bakelite </td><td> MS-4501 </td><td> «Fiole cryogénique&quot; </td></tr></table>

cryoconservation d&#39;embryons de souris par base d&#39;éthylène glycol vitrification

Cryopreservation of Mouse Embryos by Ethylene Glycol-Based Vitrification

Cryoconservation des embryons de souris est une base technologique qui soutient les sciences biomédicales, car de nombreuses souches de souris ont été produites par des modifications génétiques et le nombre est en augmentation constante d&#39;année en année. Son développement technique a commencé avec méthodes de congélation lente dans les années 1970 1, puis suivie par des méthodes de vitrification développé à la fin des années 1980 2. Généralement, cette dernière technique est avantageuse dans sa rapidité, la simplicité et la survivabilité élevée d&#39;embryons récupérés. Cependant, le contenu cryoprotecteurs sont très toxiques et peuvent affecter le développement embryonnaire ultérieur. Par conséquent, la technique n&#39;est pas applicable à certaines souches de souris, même lorsque les solutions sont refroidies à 4 ° C afin d&#39;atténuer l&#39;effet toxique lors de la manipulation d&#39;embryons. Au Centre RIKEN bioressources, plus de 5000 souches de souris avec différents fonds génétiques et les phénotypes sont maintenues 3, et donc nous avons optimisé une TE de vitrificationchnique avec laquelle nous pouvons cryoconserver embryons de nombreuses souches différentes de souris, avec les avantages de survie des embryons après vitrification haute et la décongélation (ou liquéfaction, plus précisément) à la température ambiante 4. Ici, nous présentons une méthode de vitrification des embryons de souris qui a été utilisé avec succès dans notre centre. La solution contient de l&#39;éthylène glycol cryoconservation au lieu de DMSO pour minimiser la toxicité pour les embryons 5. Il contient également de Ficoll et de sucrose pour la prévention de dévitrification et l&#39;ajustement osmotique, respectivement. Les embryons peuvent être manipulés à la température ambiante et transféré dans l&#39;azote liquide dans les 5 min. Parce que la méthode originale a été optimisé pour les pailles en plastique comme les conteneurs, nous avons légèrement modifié le protocole pour cryotubes, qui sont plus facilement accessibles dans les laboratoires et les plus résistants aux dommages physiques. Nous décrivons également la procédure de décongélation des embryons vitrifiés en détail parce que c&#39;est un ste critiquesp pour la récupération efficace des souris vivantes. Ces méthodologies serait utile aux chercheurs et aux techniciens qui ont besoin de préservation de souches de souris pour une utilisation ultérieure d&#39;une manière sûre et rentable.

Une base d&#39;éthylène glycol méthode de vitrification des embryons de souris est décrite. Il est avantageux à d&#39;autres méthodes dans sa simplicité et une faible toxicité embryonnaire, et ne peut donc être largement applicable à de nombreuses souches de souris, y compris les souris consanguines et génétiquement modifiées.

Cryoconservation d&#39;embryons de souris par base d&#39;éthylène glycol vitrification

La cryopréservation d'embryons de souris constitue une base technologique qui soutient les sciences biomédicales, car de nombreuses souches de souris ont été produites par génétique...

L'objectif général de cette procédure est de cryoconserver des embryons de souris dans de l'azote liquide et de les décongeler afin de récupérer des souris vivantes. Cela est réalisé en immergeant d'abord les embryons de souris dans un milieu d'équilibre, en les transférant ensuite dans un milieu de vitrification contenu dans un tube cryogénique, puis en les plaçant dans un réservoir d'azote liquide. Par la suite, les embryons peuvent être décongelés dans un milieu à osmolarité élevée et incubés dans un milieu de culture jusqu'à leur transfert dans des femelles réceptrices.En fin de compte, les résultats montrent une survie de plus de 90 % des embryons après décongélation par vitrification, et des taux de naissance compris entre 30 et 70 % après transfert embryonnaire. Le principal avantage de cette technique est que le cryoprotecteur perméable, le glycol, est moins toxique pour les embryons que les cryoprotecteurs conventionnels. La démonstration de la procédure sera effectuée par un technicien de mon laboratoire avant le début de ce protocole.Préparez deux embryons de souris en culture, obtenus par accouplement naturel ou par des techniques conventionnelles de FIV, dans un tube cryogénique destiné à un stockage ultérieur, puis ajoutez 50 microlitres de solution de congélation pour embryons EF S 40. Préparez ensuite une boîte de Pétri en plastique de 35 millimètres ou de 60 millimètres contenant 50 microlitres d’EFS 20 à température ambiante.Utilisez une capillaire en verre pour transférer jusqu'à 30 embryons dans la boîte. Veillez à éviter de transférer le milieu de culture. Pour assurer également la déshydratation des embryons, placez-les au fond de la goutte.Après environ 60 à 90 secondes, utilisez un tube capillaire pour prélever les embryons déshydratés. Ayant une morphologie rétractée. Transférez ces embryons dans la solution EFS contenue dans le tube cryogénique, en transférant le moins possible d’EFS 20.Une fois les embryons transférés, laissez-les se déposer dans l'EFS 40 pendant une minute avant de les congeler dans de l'azote liquide. Avant de décongeler les embryons, placez dans une boîte de culture au moins deux gouttes de 10 microlitres de milieu de culture embryonnaire à haute osmolarité, tel que le milieu M 16. Recouvrez ensuite complètement les gouttes d'huile de silicone ou d'huile minérale, et placez la boîte dans un incubateur au dioxyde de carbone jusqu'à utilisation.Ensuite, réchauffez la solution TS un à 37 degrés Celsius tout en portant un masque facial et des gants cryogéniques. Récupérez les embryons du réservoir d'azote liquide. Ouvrez maintenant rapidement le tube cryogénique et jetez tout azote liquide dans le réservoir ou tout récipient approprié.Attendre ensuite 30 secondes. Ajouter maintenant 850 microlitres de la solution TS1 tiède dans le tube cryo. Aspirer et expulser doucement la solution environ 10 fois afin qu'elle se dissolve uniformément.Ensuite, transférez tout le volume dans une boîte de Pétri en plastique de 60 millimètres de diamètre. Ou laissez sur une lame de verre pendant trois minutes afin que les embryons s'équilibrent à la température ambiante, où ils doivent rester pour la durée restante de la procédure. N'utilisez aucun dispositif de chauffage.Examinez rapidement les embryons dans la boîte sous un microscope stéréoscopique afin de connaître leur apparence au début de cette incubation. Après environ deux minutes d'incubation, faites couler les embryons en secouant doucement la boîte jusqu'à ce que le milieu soit réparti sur la surface de celle-ci. Pendant la dernière minute d'incubation, éjectez trois gouttes distinctes de 50 microlitres de la solution TS deux dans une boîte. Lorsque les trois minutes sont écoulées, utilisez un microscope stéréo pour confirmer que les embryons se sont légèrement rétractés. Si les embryons sont encore gonflés, poursuivez l'incubation de une à trois minutes supplémentaires. Prélevez maintenant les embryons à l’aide d’une capillaire en verre et transférez-les dans la première goutte de TS deux.Attendre trois minutes et transférer les embryons dans la deuxième goutte. Suivre par la troisième goutte. Enfin, récupérer la boîte contenant le milieu pour embryons préparé stockée dans l’incubateur, et utiliser une capillaire en verre pour transférer les embryons dans la première goutte du milieu.Si on les examine au stéréomicroscope, les embryons doivent lentement retrouver leur morphologie normale. Remettez maintenant la boîte dans l'incubateur pendant environ 10 minutes. Ensuite, rincez pour éliminer le saccharose qui a été transféré du TS deux.Transférez les embryons dans la goutte suivante de milieu de culture. Poursuivez la culture des embryons dans l’incubateur à CO2 jusqu’à leur transfert dans l’utérus de femelles receveuses. Après vitrification et récupération de 300 à 480 embryons provenant de trois souches de souris différentes, la survie a été très élevée.Après décongélation, la fraction d'embryons présentant une morphologie normale était comprise entre 93 et 99 %, et au moins 84 % de ces embryons se sont développés en blastocystes. N'oubliez pas que le travail avec de l'azote liquide peut être extrêmement dangereux, et que des précautions doivent être prises pour éviter tout contact direct et réduire au minimum l'exposition à courte distance en cas de fuite. L'azote doit toujours être manipulé en suivant cette procédure.

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Dans cette vidéo, article, nous présentons une démonstration étape par étape sur la façon de recueillir et de cryopréservation des ovocytes de hamster avec des taux élevés de survie post-dégel. La même procédure peut également être appliquée avec succès gel et de dégel des embryons de souris à différents stades de développement préimplantatoire.

Collecte et cryoconservation des ovocytes de hamster et d&#39;embryons de souris

Embryons peuvent être cryoconservés préimplantatoire après le placement dans une solution hypertonique cryoprotecteurs pour provoquer une déshydratation cellulaire. Après équilibration, la formation de cristaux de glace est induite dans la solution environnante de l'embryon. Déshydratation survient plus que l'embryon est refroidi lentement à des températures inférieures à zéro avant de plonger dans l'azote liquide pour le stockage.

Cryoconservation d&#39;embryons pré-implantatoire de bovins, ovins et caprins

Ici nous démontrons l'nouvellement développé, je • Cryo Kit pour la cryoconservation du sperme de souris. Deux cellules du développement embryonnaire scène avec des spermatozoïdes congelés-décongelés a été améliorée de manière cohérente dans cinq souches de souris à l'utilisation de ce kit. Sur une période de 1,5 années, 49 lignées de souris génétiquement modifiées ont été archivées par la cryoconservation du sperme avec le kit I • Cryo et plus tard avec succès récupéré par FIV.

Cryoconservation du sperme de souris et de récupération utilisant les I · Cryo Kit

Dans cette vidéo, nous décrivons la procédure de vitrification des embryons de lapin récoltés au stade de développement souhaité en utilisant de l’éthylène glycol et du diméthylsulfoxyde comme cryoprotecteurs et de la paille cryogénique comme système de transport. Les embryons vitrifiés ont un taux de survie élevé et peuvent être conservés pendant une période prolongée jusqu’à leur utilisation.

Vitrification d’embryons de lapin à l’aide de paille cryogénique : une technique de refroidissement ultra-rapide pour préserver les embryons de lapin en vue d’un stockage à long terme

Cette vidéo montre la procédure de décongélation des embryons de lapin vitrifiés et les étapes de mesure de précaution pour une récupération optimale des embryons.

Décongélation d’embryons de lapin : une procédure de réchauffement pour récupérer des embryons de lapin cryoconservés pour le transfert d’embryons

Le transfert d'embryons utéro-tubaire utilise la jonction utéro-tubaire comme une barrière pour empêcher l'écoulement de l'embryon qui peut se produire lors de l'exécution de transfert de l'utérus. Les hommes ayant subi une vasectomie sont nécessaires pour obtenir bénéficiaires pseudo-pour le transfert d'embryon. Ces deux techniques sont discutées.

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MicroSecure Vitrification a été développé en tant que système de dispositif de vitrification fermé aseptique non commercial, conforme aux bonnes pratiques de fabrication et de manipulation des tissus de la FDA. En raison du retrait des pailles d’embryons bouchés hydrophobes de l’industrie, la procédure de vitrification a été modifiée pour inclure un joint intérieur avant le bouchon intérieur en coton standard.

Modifié MicroSecure Vitrification: Une très procédure Cryoconservation sûre et efficace, simple et blastocystes humains

Les techniques de procréation assistée (ARTs) sont en évaluation continue pour améliorer les résultats et réduire les risques associés. Ce manuscrit décrit une procédure de transfert d’embryons mini-invasive avec un protocole de cryoconservation efficace qui permet l’utilisation de lapins comme modèle animal idéal de reproduction humaine.

Transfert d’embryon et vitrification d’embryons au stade optimal de l’embryon dans le modèle Rabbit

Nous présentons ici un protocole de time-lapse morphométriques pour suivre l’intensité du rétrécissement du blastocyste et re-expansion durant les interventions de previtrification et récupération après réchauffement. L’application du protocole est possible dans les laboratoires in vitro fertilization équipés de microscopes time-lapse et est recommandée dans le développement d’une méthode de vitrification de blastocyste optimale.

Morphométrique protocole pour l’évaluation Objective du comportement de blastocyste pendant la Vitrification et étapes de réchauffement de la planète

Ici, nous présentons une méthode modifiée pour la cryoconservation des embryons à une cellule ainsi qu’un protocole qui couple l’utilisation d’embryons dégelés et l’électroporation pour la génération efficace de souris génétiquement modifiées.

Utilisation d’embryons décongelés par le gel pour la production à haut rendement de souris génétiquement modifiées

Ici, nous présentons le protocole Spatula Montevideo pour vitrifier les embryons préimplantatoires de souris et de moutons, composé d’une spatule faite maison et utilisant des solutions faites maison. Les embryons sont rapidement équilibrés dans deux solutions cryoprotectrices de concentration croissante, chargés sur la spatule, immergés dans de l’azote liquide et enfin scellés avec une paille de 0,5 ml.

Spatule Montevideo Dispositif pour la vitrification d’embryons de mammifères

Apprenez la cryoconservation d'embryons de souris par vitrification au glycol d'éthylène. Cette méthode simple offre des taux de survie supérieurs à 90% et minimise la toxicité embryonnaire pour diverses souches.

Cryoconservation d'embryons de souris par base d'éthylène glycol vitrification

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