Cryoconservation d'embryons de souris par base d'éthylène glycol vitrification

L’objectif global de cette procédure est de cryoconserver des embryons de souris dans de l’azote liquide et de les décongeler pour récupérer des souris vivantes. Pour ce faire, on plonge d’abord les embryons de souris dans un milieu d’équilibrage, puis on les transfère dans un milieu de vitrification dans un tube cryogénique, puis on les place dans un réservoir d’azote liquide. Plus tard, les embryons peuvent être décongelés dans un milieu osmotique élevé et incubés dans un milieu de culture jusqu’à ce qu’ils soient transférés dans des femelles receveuses.

En fin de compte, les résultats montrent que plus de 90 % des embryons ont survécu après la décongélation par vitrification et que les taux de natalité se sont élevés entre 30 et 70 % après le transfert d’embryons. Le principal avantage de cette technique est que le cryoprotecteur perméable glycol est moins toxique pour les embryons que le cryoprotecteur classique. La démonstration de la procédure sera faite par un technicien de mon laboratoire avant de commencer ce protocole.

Préparez deux embryons cellulaires de souris en culture obtenus par accouplement naturel ou techniques conventionnelles de FIV dans un tube cryogénique pour un stockage éventuel, ajoutez 50 microlitres de solution de congélation d’embryons EF S 40. Préparez ensuite une boîte de Pétri en plastique de 35 millimètres ou 60 millimètres avec 50 microlitres de température ambiante. EFS 20.

À l’aide d’un capillaire en verre, vous pouvez transférer jusqu’à 30 embryons dans la boîte. Attention à ne pas transférer le milieu de culture. Également pour assurer la déshydratation des embryons, placez-les au fond de la goutte.

Après environ 60 à 90 secondes, utilisez un tube capillaire pour prélever les embryons déshydratés. Avec une morphologie rétrécie. Déplacez ces embryons dans une solution EFS dans le tube cryogénique, en transférant le moins d’EFS 20 possible.

Une fois les embryons transférés, laissez-les se déposer dans l’EFS 40 pendant une minute avant de les congeler dans de l’azote liquide. Avant de décongeler les embryons, placez dans une boîte de culture au moins deux gouttes de milieu de culture d’embryons à haute osmolarité de 10 microlitres, tel que le milieu M 16. Ensuite, couvrez complètement les gouttes de silicone ou d’huile minérale et placez le plat dans un incubateur à dioxyde de carbone jusqu’à utilisation.

Ensuite, réchauffez la solution TS one à 37 degrés Celsius tout en portant un masque facial et des gants cryogéniques. Récupérez les embryons du réservoir d’azote liquide. Ouvrez maintenant rapidement le tube cryogénique et jetez tout azote liquide dans le réservoir ou tout récipient approprié.

Attendez ensuite 30 secondes. Ajoutez maintenant 850 microlitres de solution TS one chaude dans le tube cryogénique. Aspirez doucement et déjectez la solution environ 10 fois pour qu’elle soit dissoute uniformément.

Transférez ensuite tout le volume dans une boîte de Pétri en plastique de 60 millimètres. Ou regardez le verre attendre trois minutes pour que les embryons s’équilibrent à la température ambiante où ils devraient rester pour le reste de la procédure. N’utilisez pas de dispositif de réchauffement.

Examinez rapidement les embryons dans la boîte au microscope stéréoscopique pour savoir à quoi ils ressemblent au début de cette incubation. Après environ deux minutes d’incubation, coulez les embryons en secouant doucement le plat jusqu’à ce que le milieu soit étalé sur la surface du plat. Dans la dernière minute de l’incubation, éjectez trois gouttes distinctes de 50 microlitres de solution TS 2 dans une coupelle.

Lorsque les trois minutes sont écoulées, utilisez un stéréomicroscope pour confirmer que les embryons ont légèrement rétréci. Si les embryons sont encore gonflés, continuez l’incubation pendant une à trois minutes de plus. Maintenant, prenez les embryons avec un capillaire en verre et transférez-les dans la première goutte de TS deux.

Attendez trois minutes et transférez les embryons dans la deuxième goutte. Suivi de la troisième baisse. Enfin, récupérez le plat de milieu d’embryons préparé stocké dans l’incubateur et utilisez un capillaire en verre pour transférer les embryons dans la première goutte du milieu.

S’ils sont examinés sous stéréoscope, les embryons devraient lentement retrouver leur morphologie normale. Maintenant, remettez le plat dans l’incubateur pendant environ 10 minutes. Ensuite, pour laver le saccharose qui a été emporté de TS deux.

Déplacez les embryons vers la prochaine goutte de milieu de culture. Continuez à cultiver les embryons dans l’incubateur de CO2 jusqu’à ce qu’ils soient transférés dans l’UC des femelles receveuses. Après la vitrification et la récupération de 300 à 480 embryons de trois souches de souris différentes, la capacité de survie était très élevée.

Après décongélation, la fraction d’embryons présentant une morphologie normale était comprise entre 93 et 99 % et parmi ces embryons, au moins 84 % se sont transformés en kystes blastiques. N’oubliez pas que travailler avec de l’azote de fuite peut être extrêmement dangereux et des précautions pour éviter le contact direct et minimiser l’exposition à courte distance aux fuites. L’azote doit toujours être pris en effectuant cette procédure.