Cryoconservation d'embryons de souris par base d'éthylène glycol vitrification

L'objectif général de cette procédure est de cryoconserver des embryons de souris dans de l'azote liquide et de les décongeler afin de récupérer des souris vivantes. Cela est réalisé en immergeant d'abord les embryons de souris dans un milieu d'équilibre, en les transférant ensuite dans un milieu de vitrification contenu dans un tube cryogénique, puis en les plaçant dans un réservoir d'azote liquide. Par la suite, les embryons peuvent être décongelés dans un milieu à osmolarité élevée et incubés dans un milieu de culture jusqu'à leur transfert dans des femelles réceptrices.

En fin de compte, les résultats montrent une survie de plus de 90 % des embryons après décongélation par vitrification, et des taux de naissance compris entre 30 et 70 % après transfert embryonnaire. Le principal avantage de cette technique est que le cryoprotecteur perméable, le glycol, est moins toxique pour les embryons que les cryoprotecteurs conventionnels. La démonstration de la procédure sera effectuée par un technicien de mon laboratoire avant le début de ce protocole.

Préparez deux embryons de souris en culture, obtenus par accouplement naturel ou par des techniques conventionnelles de FIV, dans un tube cryogénique destiné à un stockage ultérieur, puis ajoutez 50 microlitres de solution de congélation pour embryons EF S 40. Préparez ensuite une boîte de Pétri en plastique de 35 millimètres ou de 60 millimètres contenant 50 microlitres d’EFS 20 à température ambiante.

Utilisez une capillaire en verre pour transférer jusqu'à 30 embryons dans la boîte. Veillez à ne pas transférer le milieu de culture. Pour assurer également la déshydratation des embryons, placez-les au fond de la goutte.

Après environ 60 à 90 secondes, utilisez un tube capillaire pour aspirer les embryons déshydratés. Ayant une morphologie rétractée. Transférez ces embryons dans la solution EFS contenue dans le tube cryogénique, en transférant le moins possible d’EFS 20.

Une fois les embryons transférés, laissez-les se déposer dans l'EFS 40 pendant une minute avant de les congeler dans de l'azote liquide. Avant de décongeler les embryons, placez dans une boîte de culture au moins deux gouttes de 10 microlitres de milieu de culture embryonnaire à haute osmolarité, tel que le milieu M 16. Recouvrez ensuite complètement les gouttes d'huile de silicone ou d'huile minérale, puis placez la boîte dans une incubateur à dioxyde de carbone jusqu'à utilisation.

Ensuite, réchauffez la solution TS un à 37 degrés Celsius tout en portant un masque facial et des gants cryogéniques. Récupérez les embryons du réservoir d'azote liquide. Ouvrez maintenant rapidement le tube cryogénique et jetez tout azote liquide dans le réservoir ou tout récipient approprié.

Attendez ensuite 30 secondes. Ajoutez maintenant 850 microlitres de la solution tiède TS un au tube cryo. Aspirez et expulsez doucement la solution environ 10 fois afin qu'elle se dissolve uniformément.

Ensuite, transférez tout le volume dans une boîte de Pétri en plastique de 60 millimètres de diamètre. Ou laissez sur une lame de montre pendant trois minutes afin que les embryons s'équilibrent à la température ambiante, où ils doivent rester pour la durée restante de la procédure. N'utilisez aucun dispositif de chauffage.

Examinez rapidement les embryons dans la boîte sous un microscope stéréo pour observer leur apparence au début de cette incubation. Après environ deux minutes d'incubation, faites couler les embryons en secouant doucement la boîte jusqu'à ce que le milieu recouvre toute la surface de la boîte. Pendant la dernière minute d'incubation, éjectez trois gouttes distinctes de 50 microlitres de la solution TS deux dans une boîte.

Lorsque les trois minutes sont écoulées, utilisez un microscope stéréo pour confirmer que les embryons se sont légèrement rétractés. Si les embryons sont encore gonflés, poursuivez l'incubation de une à trois minutes supplémentaires. Prélevez maintenant les embryons à l’aide d’une micropipette en verre et transférez-les dans la première goutte de TS deux.

Attendre trois minutes et transférer les embryons vers la deuxième goutte. Suivre par la troisième goutte. Enfin, récupérer le plat de milieu pour embryons préparé, stocké dans l’incubateur, et utiliser une capillaire en verre pour transférer les embryons vers la première goutte du milieu.

Si on les examine au stéréomicroscope, les embryons doivent lentement retrouver leur morphologie normale. Remettez maintenant la boîte dans l'incubateur pendant environ 10 minutes. Ensuite, rincez pour éliminer le saccharose qui a été transféré du TS deux.

Transférez les embryons dans la goutte suivante de milieu de culture. Poursuivez l'incubation des embryons dans l'incubateur à CO2 jusqu'à leur transfert dans l'utérus des femelles réceptrices. Après vitrification et récupération de 300 à 480 embryons provenant de trois souches de souris différentes, la survie était très élevée.

Après décongélation, la fraction d'embryons présentant une morphologie normale était comprise entre 93 et 99 %, et au moins 84 % de ces embryons se sont développés en blastocystes. N'oubliez pas que le travail avec de l'azote en fuite peut être extrêmement dangereux, et que des précautions doivent être prises pour éviter tout contact direct et minimiser l'exposition à courte distance à la fuite. L'azote doit toujours être manipulé en suivant cette procédure.