Mesure de l’expression des protéines dans le cerveau des rongeurs à l’aide de la fluorescence dans le proche infrarouge et du balayage à haute résolution

Prenez une lame de verre contenant des sections de tissu cérébral de rat immunomarquées pour les récepteurs AMPA et NMDA dans les neurones de l’amygdale.

Les

récepteurs AMPA médient l’afflux de sodium induit par le glutamate et la transmission synaptique excitatrice rapide.

En revanche, les récepteurs NMDA médient l’afflux de sodium et de calcium induit par le glutamate et les co-agonistes, facilitant la transmission synaptique excitatrice lente.

Les récepteurs sont colorés avec des anticorps primaires et détectés à l’aide d’anticorps secondaires marqués au fluorophore dans le proche infrarouge.

Placez la diapositive côté tissu vers le bas sur l’interface de balayage proche infrarouge.

Ajustez les paramètres d’imagerie et commencez l’imagerie.

Lors de l’éclairage laser, les fluorophores sur les récepteurs AMPA et NMDA émettent une fluorescence.

L’imagerie proche infrarouge minimise l’autofluorescence, améliorant ainsi la clarté du signal.

Le balayage haute résolution assure en outre une différenciation claire des signaux de fluorescence, permettant une visualisation précise des récepteurs AMPA et NMDA à proximité dans l’amygdale.

À l’aide d’un logiciel d’imagerie, calculez le rapport d’intensité de fluorescence AMPA/NMDA dans une région d’intérêt spécifique comme marqueur de l’apprentissage et de la mémoire.

Placez les lames sur l’interface de balayage proche infrarouge avec le tissu vers le bas. Imagez plusieurs diapositives à la fois à l’aide d’un outil de sélection. Imagez les diapositives en utilisant le réglage de qualité le plus élevé, avec une résolution de 21 micromètres. Avec un décalage de 0 nanomètre, importez des images dans le logiciel d’analyse d’images pour les afficher et les marquer pour l’analyse semi-quantitative des protéines.

Après avoir ouvert le logiciel d’analyse d’images, sélectionnez la zone de travail dans laquelle l’image a été numérisée. Ensuite, ouvrez l’image numérisée dans le logiciel d’analyse d’images pour afficher le balayage et ajustez les longueurs d’onde, le contraste, la luminosité et le grossissement affichés sans modifier l’image brute ou l’émission totale quantifiée.

Après avoir identifié les régions clés pour la quantification, sélectionnez l’onglet Analyse en haut de la page, puis sélectionnez Dessiner un rectangle pour dessiner un rectangle sur la zone à quantifier. Pour afficher la taille du rectangle, sélectionnez Formes en bas à gauche de l’écran. Ensuite, sélectionnez Colonnes en bas à droite. Ensuite, ajoutez les colonnes Hauteur et Largeur pour identifier la taille de la forme. Enfin, nommez la forme et répétez. Une fois toutes les régions échantillonnées, procédez à la combinaison et à l’analyse des données disponibles dans l’onglet Colonnes.