Microscopie à deux photons pour la surveillance de la dynamique calcique dans les photorécepteurs coniques rétiniens de souris

Placez une lamelle contenant du tissu rétinien de souris monté sur membrane sous un microscope à deux photons.

Le tissu exprime un biocapteur de calcium basé sur FRET dans les photorécepteurs coniques.

À l’aide d’un objectif d’immersion dans l’eau, concentrez-vous sur le tissu.

Sous l’éclairage de fond, les terminaisons axonales coniques restent dépolarisées, ce qui permet l’afflux de calcium.

La liaison intracellulaire du calcium modifie la conformation du biocapteur, rapprochant les fluorophores donneur et accepteur.

Commencez l’imagerie à deux photons.

Le laser du microscope focalise une lumière proche infrarouge de faible énergie dans le tissu.

Au point focal du laser, deux photons excitent simultanément le biocapteur, déclenchant un transfert d’énergie du donneur à l’accepteur.

Cela augmente la fluorescence de l’accepteur tout en diminuant la fluorescence du donneur.

Calculez le rapport de fluorescence.

Ensuite, délivrez une stimulation lumineuse pour hyperpolariser les cônes, réduisant ainsi les niveaux de calcium intracellulaire.

Cela inverse la conformation du biocapteur, inhibant le transfert d’énergie du donneur à l’accepteur et abaissant le rapport de fluorescence.

Enregistrer les réponses pour analyser la dynamique calcique évoquée par la lumière dans les terminaisons axonales coniques.

Transférez une tranche de la chambre de rétention à la chambre d’enregistrement et commencez immédiatement à la perfuser avec une solution extracellulaire caroxygénée. Maintenir un débit de perfusion de 2 millilitres par minute et une température de 37 degrés Celsius dans la chambre d’enregistrement. Utilisez un objectif d’immersion dans l’eau 20x, 0,95 NA et une caméra CCD en combinaison avec une LED infrarouge sous la chambre d’enregistrement pour localiser la tranche rétinienne.

Démarrez le système d’imagerie à deux photons, comme indiqué par le fabricant. Ensuite, allumez le laser et réglez-le sur 860 nanomètres. Activez les deux canaux de détection pour l’imagerie par fluorescence de l’ECFP et de la citrine. Ensuite, à l’aide du logiciel d’acquisition d’images, contrôlez le microscope à deux photons pour balayer et sélectionnez une rangée de terminaux coniques pour l’enregistrement. Réglez l’acquisition d’images sur des images de 128 x 16 pixels ou une configuration similaire.

Limitez la zone scannée aux bornes coniques pour éviter le blanchiment des photopigments dans les segments externes. Allumez le laser. Laissez les cônes s’adapter au laser de balayage et à la lumière de fond du stimulus pendant 20 à 30 secondes avant de présenter des stimuli lumineux ou d’appliquer des agents pharmacologiques. Maintenant, commencez la présentation des stimuli arbitraires. Les stimuli sont générés en modulant l’intensité des deux LED au fil du temps, à l’aide d’une carte à microprocesseur contrôlée par un logiciel personnalisé. Ensuite, commencez à enregistrer simultanément les deux canaux de fluorescence à l’aide du logiciel d’acquisition d’images correspondant.