Name: Isolement et caractérisation de Hoechst Faible CD45 Négatifs Souris Cellules souches mésenchymateuses du poumon (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 55 s
Description: Découvrez l'isolement et la caractérisation des cellules souches mésenchymateuses pulmonaires chez la souris. Cette méthode par cytométrie en flux permet d'étudier leurs propriétés immunomodulatrices et leur potentiel de réparation tissulaire.

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Ce travail a été financé par des subventions aux SMM: AHA GIA0855953G, NIH 1R01 HL091105-01. Un appui supplémentaire a été fourni par: DW: NIH RO1DK075013, DDK et la Fondation Kleberg; le Core flux CVUC cytométrie (NIH 5 P30 CA 46934-15), la CVUC Microarray de base (NCI P30 CA 46934-14).

1. Isolement du poumon <ol><li> Sacrifice souris adultes (8-10 semaines d'âge; 18-20 g; C57Bl6J) des souris avec une surdose d'isoflurane suivi par exsanguination utilisant une technique stérile. Profils varient légèrement entre les souches. </li><li> Enlever chirurgicalement le diaphragme, d'ouvrir la cavité thoracique en coupant la cage thoracique latéralement de chaque côté de la souris. Rincer le sang des poumons en perfusant le ventricule droit du cœur doucement à l'aide de 3 5 ml de tampon phosphate salin (PBS). </li><li> Disséquer les lobes pulmonaires enlever la trachée les bronches et les grands et les placer dans une boîte de Pétri remplies de solution saline tamponnée de Hanks (HBSS). Après la collecte des lobes pulmonaires tous les forceps sont utilisés pour placer le tissu sur le couvercle du plat. Tissu est ensuite hachée en petits morceaux à l'aide de scalpels jetables avec assez de liquide pour les garder humides, mais pas tant qu'elles flottent et se déplacent. </li><li> Disséquer une patte arrière d'une des souris et d'isoler la moelle osseuse pour l'utiliser comme un contrôle pour régler la coloration flow cytométrie portes. Tache de la moelle osseuse (BM), comme décrit précédemment 1. </li></ol> 2. Préparation d'une suspension cellulaire unique des tissus pulmonaires <ol><li> Chaque poumon est digérée en utilisant un poids optimisé pour les tissus rapport en volume de 0,2 g: 5 ml de pré-chauffé à 0,2% Worthington type 2 collagénase (Biochemicals Worthington, Lakewood, NJ; # cat LS004202) dissous dans du HBSS stérile. Le mélange est immergé dans un bain d'eau à 37 ° C pendant 30 min 2,3. </li><li> Triturer échantillon bien digérer jusqu'au tissu pulmonaire s'écoule facilement par une pipette de 10ml (environ 10 répétitions). Incuber pendant 15 min supplémentaires à 37 ° C pour compléter le tissu digère et assure une suspension cellulaire plus uniforme unique. </li><li> Diluer la suspension de cellules de poumon avec HBSS et triturer avec une pipette de 5 ml pour disperser des fragments de tissu résiduel. </li><li> Filtrer la suspension cellulaire à l'aide d'une passoire pour enlever 70μM fragments de tissus non digérés. L'échantillon peut être divisé en multipltubes coniques e à ce point pour éviter la surcharge des cellules et une crépine de diminuer le temps. </li><li> Pellet la suspension cellulaire pendant 10 min à 1500 rpm et décanter le surnageant. </li><li> Resuspendre le culot cellulaire en douceur en utilisant la température ambiante RBC tampon de lyse (eBiosciences, San Diego, CA; # cat 00-4333-57) et incuber à température ambiante pendant 5 min. Ajouter un volume égal de HBSS pour inactiver le tampon de lyse et de filtrage de la suspension cellulaire à l'aide d'une passoire cellules 40μM pour enlever les débris et les agrégats cellulaires. </li><li> Pipeter 10 ul de chaque échantillon à être colorées et de compter le nombre de cellules à la fois pour le poumon et les échantillons de BM en utilisant un hématimètre. Remarque: enregistrer le volume total des cellules. </li><li> Pellet la suspension cellulaire unique de cellules pulmonaires par centrifugation à 1500 rpm pendant 10 min. </li><li> Resuspendre deux poumons et les cellules BM au 1x10 6 cellules / ml dans préchauffé (37 ° C) DMEM + (milieu de Dulbecco modifié Eagle, élevée en glucose (Gibco, Carlsbad, CA; # cat 11965-092) contenant 2% de fœtus BoviNE sérum (FBS) et HEPES 10 mM. </li><li> Préparer une solution stock de 1mg/ml de Hoechst 33342 colorant (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO; # cat B2261) dans l'eau et stériliser par filtration 1,4. Le colorant Hoechst peuvent être stockées sous forme d'aliquots à -80 ° C. </li><li> Ajouter Hoescht 33342 teinture à une concentration finale de 5μg/ml (une dilution 200x d'un stock 1mg/ml) à la suspension cellulaire unique. </li><li> Mélanger délicatement les cellules par l'inversion et incuber à 37 ° C l'eau de bain pour exactement 90 minutes. </li></ol> 3. Coloration et préparation de la suspension cellulaire du poumon pour l'analyse de cytométrie en flux <ol><li> Après 90 minutes toutes les étapes avec les cellules des poumons tachés Hoechst doit être exécuté à 4 ° C ou sur la glace pour empêcher l'efflux de teinture. Pellet les cellules par centrifugation à 1500 rpm pendant 10 min à 4 ° C et remettre en suspension les cellules dans tampon glacé coloration (PBS 2% de FBS). </li><li> Resuspendre les cellules à une concentration ne dépassant pas 1x10 7 cellules / tube à l'aide de 300 600μl de PBS contenant 2%FBS et HEPES 10 mM. </li><li> Ajouter suffisamment ricanait CD45 (généralement 1:200 dilution du CD45-APC (BD Pharmingen, San Diego, CA; # cat 559864) dans les poumons et les échantillons BM Incuber sur la glace pendant 10-15 minutes incluant un contrôle sans tache lors de la.. procédure expérimentale est utile de définir les portes d'analyse. </li><li> Pellet cellules à 4 ° C pendant 5 min à 1500 rpm. Décanter le surnageant et les cellules remettre en suspension dans 500 pl de tampon de coloration glacée (PBS 2% de FBS). Transfert à prechilled tubes pression bouchon en polypropylène (Fisherbrand, Schaumburg, IL, chat N ° 14-956-1D). </li><li> Ajouter l'iodure de propidium (PI, le stock 200μg/ml dans le PBS) pour les échantillons pour une concentration finale de 2μg/ml d'exclure les cellules mortes. PI doit être utilisé en combinaison avec le colorant Hoechst 33342 pour atteindre le bon profil de fluorescence lors de l'analyse par cytométrie en flux. </li><li> Conserver les tubes sur la glace, abri de la lumière jusqu'à l'analyse par cytométrie en flux. </li></ol> 4. Cytométrie en flux pour définir et isolerUne cellule souche du poumon mésenchymateuses (CSM poumons) Population utilisant colorant Hoechst Efflux pour détecter une population Side (SP) <ol><li> Ce test a des exigences instruments suivants: </li><ul><li> 488 nm et UV (350-355 nm) lasers </li><li> 2 détecteurs sur le chemin de laser UV avec du bleu (450/65) et rouge (675/50) filtres. </li><li> Le détecteur UV rouge doit avoir une sensibilité élevée pour le signal rouge. Cela peut être un problème avec les trieurs de cellules plus âgées. </li><li> Unité de refroidissement pour maintenir l'échantillon à 5-10 ° C. </li></ul><li> Aligner les lasers et mis en place pour le tri des cellules selon le protocole du fabricant. </li><li> Recueillir le rouge (axe x) et bleu (axe des y) en utilisant des signaux Hoechst une échelle linéaire. </li><li> Ajustez les tensions tube photomultiplicateur de placer le pic G0/G1 en haut à droite du centre de la parcelle pour permettre l'affichage adéquate de la population côté arrière. Une partie de la phase S et l'ensemble du G2 du cycle cellulaire peut être hors-échelle sur la droite supérieure de la parcelle. Le SIG bleuenal est relativement lumineux tandis que le signal rouge est sombre. Typiques MoFlo XDP (Beckman Coulter, Miami, FL) les tensions sont 425 pour le bleu et 650 pour le rouge. </li><li> Les cellules mortes sont déclenchées à l'aide de PI. La voie standard IP (excitation 488nm, émission 630 nm) peuvent être utilisés. Alternativement, le PI est aussi excité par le laser UV et la population de cellules mortes se trouve au large échelle sur le côté droit du côté de la population (SP) intrigue. Cela allège le besoin de compenser le signal PI de tout autres fluorochromes tels que le FITC et PE. La méthode originale Goodell a suivi les procédures dernière 5-7. </li><li> Maintenir une pression différentielle relativement faible en cours d'analyse et de tri pour assurer la résolution de la population serrée côté. </li><li> Le SP apparaît comme un bras latéral en dehors de la principale population de cellules du poumon. Cette population est appelée Hoechst faible. </li><li> Le faible Hoechst / SP est analysé pour séparer les populations CD45 positifs et négatifs en utilisant un histogramme 2,3 (Figure 1). </li><li> Après sélection et gating des Hoechst faible CD45 neg population pulmonaires MSC les cellules peuvent être recueillies par le tri soit comme une population mixte dans un tube ou des cellules individuelles pour isoler les clones dans une plaque de 96 puits 3. </li><li> Pour la plaque de tri la déviation flux de tri est ajusté à 25% pour créer un flux de tri plus verticale que celle habituellement utilisée pour le tri des tubes. </li><li> Viser le flux de tri en envoyant une impulsion sur le flux de test en haut à gauche puis en bas à droite des puits d'une plaque de 96 puits. </li><li> Réglez le plan de la plaque trieuse logiciels de déposer le nombre souhaité de cellules dans chaque puits. </li><li> Pour isoler des clones de cellules unique un seul poumon MSC est trié dans le puits d'une plaque de 96 puits dans 150μl de la culture médiatique (α-MEM additionné de SVF 20%). Après le tri supplémentaire de 100 ul une moyenne est ajoutée. </li></ol> 5. L'isolement, la culture et de caractérisation des poumons MSC et clones <ol><li> Culture et l'expansion de la population des poumons MSC mixtes et des clones de cellules unique à la suite de tri est identique en utilisant les conditions de culture standard (37 ° C, 5% de CO 2 et de l'humidité&gt; 95%). Les cellules sont admises à adhérer l'isolement pendant 16 heures suivantes. Media est remplacé toutes les 48 heures (α-MEM additionné de SVF 20%). Quand les cellules commencent à proliférer plus rapidement et atteindre entre 75-80% de confluence sont repiquées (figure 2). </li><li> Les cellules sont rincées avec HBSS préchauffée et incubées avec 0,5% de trypsine / EDTA (Cellgro, Manassas, en Virginie, cat # 25-053-Cl) à 37 ° C pendant moins de 2 min. Les cellules sont surveillées en utilisant un champ inversé pour confirmer l'apparition d'une suspension cellulaire. </li><li> Lung MSC sont ensuite divisées au ratio de 1:2 ou 1:3 en fonction du taux de prolifération actuelle de la culture. </li><li> La capacité des poumons CSM à se différencier en lignées mésenchymateuses traditionnelle des ostéoblastes, adipocytes et chondrocytes et de leur expression à la surface des cellules mésenchymateuses du acceptées marqueurs is évaluée pour chaque préparation cellulaire. L'analyse cytogénétique de bandes est également effectuée pour confirmer l'absence d'anomalies chromosomiques 2,3,8-11 brute. </li></ol> 6. Énumération des MSC pulmonaires en utilisant un dosage formant colonies (UFC-F) <ol><li> Diluer les cellules dans un milieu de MesenCult complet (Stem Cell Technologies, Vancouver, C.-B.) à une concentration finale de 1x10 6 cellules / ml. </li><li> Effectuer des dilutions en série pour obtenir des concentrations finales dans un plat de 100mm de 6x10 4 cellules, 3x10 4 cellules, 1,5 x10 4 cellules et 0,75 x10 4 cellules dans 10 ml de médias. Les analyses sont effectuées en triple double ou pour chaque concentration de cellules et peut être adapté pour les petites surfaces. </li><li> Cellules en culture pendant 10 jours dans des conditions standard. Le jour 10 cellules sont rincées avec du PBS et fixées avec du méthanol à 100% pendant 5 minutes à température ambiante. </li><li> Détecter les colonies CFU-F par coloration avec 0,4% p / v de solution de coloration de Giemsa(Sigma Chemical Co, St. Louis, MO) diluée 1:20 avec de l'eau déminéralisée. Laisser les échantillons sécher à l'air et de quantifier le nombre de colonies contenant plus de 25 cellules par colonie (Figure 3). </li></ol> 7. L'analyse des propriétés immunomodulatrices des CSM sur les poumons des cellules T-prolifération et l'apoptose <ol><li> 6.25x10 4 cellules par puits MSC pulmonaires sont étalées dans des plaques 96 puits et on laisse reposer deux pendant la nuit. </li><li> Cellules CD4 + à partir de rates de récepteur des cellules T (TCR) de souris transgéniques, l'OT-II avec des cellules T qui reconnaissent l'ovalbumine 323-339 peptide, sont purifiés par appauvrissant CD8 +, CD19 +, CMH-II + et CD25 + avec une trieuse de cellules Miltenyi Automacs (Miltenyi, Auburn, CA). Cellules présentatrices d'antigènes (APC) sont isolés par tri positif du CMH-II + 12 cellules. </li><li> APC sont fixés dans du paraformaldéhyde 4%, lavé 3 fois en PBS / EDTA 5% BSA/2mM, et chargé avec 0.5μg/ml ou 5 ug / mL OVA323 peptide. </li><li> Simulés, la croissance arrêtée APC sont ajoutés à la MSC du poumon chez les plaques à 96 puits. </li><li> Plus de 95 CD4 + 1x10% pur 5 cellules sont marquées avec 5 um carboxyfluorescéine ester succinimidyle (CFSE; Sigma, St.Louis MO) dans du PBS et incubées pendant 5 min dans le noir, lavé avec du PBS-BSA 5%, et ensuite ajouté à la APC et les cellules du poumon chez MSC DMEM 5% FBS médias. Les cellules sont ensuite incubées pendant 96 heures. </li><li> Les cellules T sont ensuite colorées avec des anti anti-CD40 (Cy5); CD4 (APC-Cy7); CD8 (ViolBlue); Vbeta 5 (PE) et analysés en utilisant un Miltenyi MacsQuant 7 cytomètre en flux de canal (Miltenyi, Aurburn, CA) et Flojo logiciel d'analyse (Treestar, Ashland, OR). La prolifération est mesurée comme la diminution de l'intensité moyenne de fluorescence CFSE par rapport à l'arrière-plan, les cellules T étiquetés avec CFSE et non exposés à l'APC (figure 4). T-cellules sont comptées à cette époque et la viabilité évaluée avec exclusion du bleu trypan. </li></ol> 8. Les résultats représentatifs: L'analyse des flux Figure 1. Cytométrique et définition des MSC du poumon. Suspensions cellulaires simples de tissu pulmonaire digérer sont colorés avec Hoechst 33342 et analysées par cytométrie en flux pour détecter des différences dans A. diffusion vers l'avant (FSC) et le côté scatter (SSC) et B. Hoechst bleu et rouge de fluorescence. La présence d'une population de côté (SP) est visible dans la porte. Le Hoechst faible SP est ensuite analysé pour séparer les C. CD45 négative de la population de MSC du poumon. Le CD45 positive à négative des ratios de cancer du poumon SP sont généralement 70:30 / 60:40. <img src="/files/ftp_upload/3159/3159fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Isolement et culture de MSC du poumon. Après la collecte du MSC poumon par tri cellulaire, les cellules sont étalées dans les plats de 30mm en utilisant α-MEM Supplémented avec du FBS à 20%. Une. Fraîchement cellules triées apparaissent petit, rond et lumineux. B. Après environ 2-3 semaines colonies avec un phénotype mésenchymateux devenu évident et la prolifération est plus évidente. <img src="/files/ftp_upload/3159/3159fig3.jpg" alt="Figure 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> Figure 3. Dénombrement des MSC par Colony Forming-Assay fibroblastes. Pulmonaires élargi MSC sont plaquées par le protocole décrit pour le dosage de CFU-F. A. Après 10 jours et les colonies Giemsa sont évidents. Colonies B. sont grandes et composé d'un quelques centaines de cellules. C. Les cellules présentent un phénotype mésenchymateux. A &amp; B, barre d'échelle = 0,5 cm; barre d'échelle C = 0,14 cm. <img src="/files/ftp_upload/3159/3159fig4.jpg" alt="Figure 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 4"> Figure 4. CFSE dosage basé T prolifération cellulaire. En l'absence de MSC pulmonaires et la présence de antigen cellules présentatrices d'(APC) + / - ovalbumine (OVA) CD40 des cellules T effectrices positifs démontrent une diminution de l'intensité CFSE qui indique la prolifération (cercle rouge). L'intensité de fluorescence CFSE de la membrane des lymphocytes T diminue avec chaque stoechiométrique soit la division cellulaire. avec chaque division. En présence de cancer du poumon MSC, APC + / - OVA, le CD40 des cellules T effectrices positifs démontrent aucun changement significatif dans l'intensité CFSE qui indique une absence de prolifération (cercle rouge).

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</ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

Nous avons adapté une méthode initialement utilisée pour identifier BM cellules hématopoïétiques à isoler une population spécifique de MSC poumon résident. En raison de la reproductibilité de l&#39;isolement de ces cellules ont ensuite été bien caractérisés comme MSC. Leur origine a été définie en tant que résident dans les poumons de souris adulte (par opposition aux dérivés BM) et un profil phénotypique et moléculaire documentée 2. La capacité d&#39;isoler plusieurs reprises cette population caractérisée permet une étude plus approfondie de l&#39;importance biologique et le rôle du CSM du poumon au cours homéostasie tissulaire et la maladie. La définition récente de cette population in vivo dans les tissus pulmonaires à la fois humain et murin facilite le développement d&#39;une stratégie thérapeutique visant à la rescousse des cellules endogènes pour faciliter la réparation du poumon au cours blessures et des maladies.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du réactif </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commentaires (optionnel) </th></tr><tr><td> Tampon phosphate salin (PBS) </td><td> Sigma </td><td> P-5368 </td><td></td></tr><tr><td> Hanks solution saline tamponnée (HBSS) </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30588.01 </td><td></td
></tr><tr><td> 0,2% de type 2 Worthington collagénase </td><td> Biochimiques Worthington </td><td> LS004202 </td><td></td
></tr><tr><td> Rouge tampon de lyse des globules </td><td> eBiosciences </td><td> 00-4333-57 </td><td></td
></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen Gibco </td><td> 11965-092 </td><td></td
></tr><tr><td> Hoechst 33342 colorant </td><td> Sigma </td><td> B2261 </td><td></td
></tr><tr><td> CD45-APC </td><td> BD Pharmingen </td><td> 559864 </td><td></td
></tr><tr><td> L&#39;iodure de propidium </td><td> Sigma </td><td> 81845 </td><td></td
></tr><tr><td> a-MEM </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30265.01 </td><td>; </td
></tr><tr><td> FBS </td><td> Invitrogen </td><td> 16000-069 </td><td></td
></tr><tr><td> 0,5% de trypsine / EDTA </td><td> Cellgro </td><td> 25-053-Cl </td><td></td
></tr><tr><td> Medium MesenCult complète </td><td> Stem Cell Technologies </td><td> 05511 </td><td></td
></tr><tr><td> 0,4% p / v de solution de coloration de Giemsa </td><td> Sigma </td><td> GS1L </td><td></td
></tr><tr><td> Paraformaldéhyde à 4% </td><td> Services de microscopie électronique </td><td> 15710 </td><td> Paraformeldehyde 16% est dilué à 4% en utilisant PBS </td
></tr><tr><td> Carboxyfluorescéine succinimidyl ester (CFSE) </td><td> Sigma </td><td> 21888 </td><td></td
></tr></tbody></table>

isolement et caractérisation de hoechst faible cd45 négatifs souris cellules souches mésenchymateuses du poumon

Isolation &#38; Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

Tissu cellules résidentes souches mésenchymateuses (CSM) sont des régulateurs importants de réparation ou de régénération tissulaire, la fibrose, l&#39;inflammation, l&#39;angiogenèse et la formation de tumeurs. Prises ensemble, ces études suggèrent que les MSC pulmonaires résidents jouent un rôle lors de l&#39;homéostasie tissulaire pulmonaire, une lésion et de réparation au cours des maladies comme la fibrose pulmonaire (PF) et l&#39;hypertension artérielle (HPA). Nous décrivons ici une technologie de définir une population de MSC poumon résident. La définition de cette population dans le tissu pulmonaire in vivo utilisant un ensemble de marqueurs définissent facilite l&#39;isolement répété d&#39;une population de cellules souches bien caractérisées par cytométrie en flux et l&#39;étude d&#39;un type cellulaire et la fonction spécifiques.

Dans cet article, nous démontrons l&#39;isolement des souris des cellules pulmonaires souches résidentes mésenchymateuses (CSM poumons), leur expansion, la caractérisation et l&#39;analyse des propriétés immunomodulatrices.

Isolement et caractérisation de Hoechst Faible CD45 Négatifs Souris Cellules souches mésenchymateuses du poumon

Les cellules souches mésenchymateuses (CSM) résidentes des tissus sont des régulateurs importants de la réparation ou de la régénération tissulaire, de la fibrose, de l'inflammation, de l'angiogenèse et des tumeurs...

Ce vidéo montre un protocole pour l'isolement de cellules souches mésenchymateuses pulmonaires négatives pour le CD45 faible de l'hôte. Les cellules souches mésenchymateuses, ou MSC, sont des régulateurs importants de la réparation ou de la régénération tissulaire, de la fibrose, de l'inflammation et de l'angiogenèse. Premièrement, les poumons sont disséqués à partir d'une souris sacrifiée.Le tissu pulmonaire est digéré afin d'obtenir une suspension monocellulaire. Les cellules sont marquées au colorant hoax et à l'anticorps anti-CD45, puis triées par cytométrie en flux pour obtenir les CSM pulmonaires CD45 négatives et faiblement exprimées chez l'hôte. Les CSM pulmonaires sont ensuite mises en culture pour expansion, et un test de formation de colonies est réalisé afin d'évaluer leurs capacités de différenciation. Des études supplémentaires peuvent ensuite être menées afin d'examiner le rôle des cellules souches mésenchymateuses lors de l'homéostasie tissulaire et des maladies. La méthode que nous présentons ici permet d'isoler des cellules souches mésenchymateuses pulmonaires de souris ou humaines, et peut être appliquée à l'étude de maladies pulmonaires telles que la fibrose pulmonaire, l'hypertension pulmonaire et la BPCO. En général, les personnes novices dans cette méthode éprouvent des difficultés en raison de la variété des méthodes disponibles pour la préparation des tissus, ainsi que pour la configuration du cytomètre en flux, les contrôles appropriés et l'analyse.La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car il est difficile de décrire par des mots la technique appropriée pour hacher et digérer le tissu pulmonaire afin d'obtenir une viabilité optimale des cellules. De plus, la configuration de l'appareil de cytométrie en flux et les analyses sont mieux transmises par une démonstration. Commencez ce protocole en retirant les poumons qui seront utilisés pour obtenir des cellules souches mésenchymateuses d'une souris adulte sacrifiée.Utilisez une petite paire de ciseaux pointus pour couper latéralement la cage thoracique de chaque côté de la souris. Ouvrez la cavité thoracique, puis retirez le diaphragme. Insérez une seringue de 10 millilitres équipée d'une aiguille de calibre 20 et demi dans le ventricule droit du cœur et appuyez doucement sur le piston pour perfuser trois à cinq millilitres de PBS, éliminant ainsi le sang des poumons.Ensuite, à l’aide de ciseaux, sectionez la trachée et les gros bronches, puis jetez-les. Puis, à l’aide de pinces, saisissez les petits lobes pulmonaires blancs et placez-les dans une boîte de Pétri remplie de solution saline tamponnée au Hank ou HBSS.Ensuite, retirez le cœur et séparez les lobes pulmonaires. Répétez ce processus pour toutes les souris de l'étude. Transférez les lobes pulmonaires sur le couvercle de la boîte.Humidifiez le tissu avec juste assez de HBSS pour éviter qu’il ne s’assèche. Ensuite, à l’aide d’un scalpel jetable, hachez les lobes pulmonaires afin d’obtenir de la moelle osseuse à utiliser comme contrôle de maintien pour la cytométrie en flux. Utilisez une paire de ciseaux pointus pour couper au niveau de la cheville et de l’extrémité supérieure du fémur.Placer le membre dans une nouvelle boîte de Pétri. Ensuite, couper le genou, en laissant un segment linéaire de fémur et un deuxième segment contenant le tibia et la fibula. À l’aide de pinces, retirer le muscle pour mettre à nu le tibia, la fibula et le fémur.Prenez maintenant une seringue de cinq millilitres munie d'une aiguille de calibre 26 et demie et insérez l'aiguille dans l'orifice de la moelle osseuse. À une extrémité du tibia, tenez l'os avec l'autre extrémité dirigée vers un tube conique de 50 millilitres contenant 15 millilitres de HBSS, puis appuyez sur le piston pour délivrer le HBSS et rincer la moelle osseuse dans le tube. Répétez ce processus avec une fibula et un fémur.Colorer la moelle osseuse avec l'hôte 3 3 3 4 2 à une concentration finale de cinq microgrammes par millilitre dans du DMEM à haut glucose supplémenté. Ensuite, une suspension monocellulaire de tissu pulmonaire sera préparée à partir du tissu isolé. Placer chaque poumon dans un tube contenant du Worthington 0,2 % préchauffé.Préparez la collagénase de type II dans du HBSS stérile, puis immergez le tube dans un bain-marie à 37 degrés Celsius et incubez pendant 30 minutes. Après l'incubation, utilisez la pipette de 10 millilitres pour triturer l'échantillon jusqu'à ce que le digest s'écoule facilement à travers la pipette. Effectuez environ 10 répétitions, puis incubez pendant 15 minutes supplémentaires à 37 degrés Celsius pour terminer la digestion tissulaire.Une fois la digestion terminée, diluez la suspension cellulaire avec du HBSS et utilisez une pipette de cinq millilitres pour tenter à nouveau de disperser les fragments tissulaires résiduels. Ensuite, afin d'éliminer les fragments tissulaires non digérés, versez la suspension à travers un tamis cellulaire de 70 micromètres dans un tube conique de 50 millilitres. Ajoutez la suspension petit à petit pour permettre à l'échantillon de traverser le tamis cellulaire.Si des fragments de tissu non digérés bloquent complètement l'écoulement de la suspension cellulaire, versez-la à travers un nouveau filtre à cellules dans un nouveau tube. Faites centrifuger la suspension cellulaire pendant 10 minutes à 450 RCF.Après la centrifugation, décanter le surnageant et redisperser délicatement le culot cellulaire dans du tampon d'hémolyse à température ambiante. Incuber à température ambiante pendant cinq minutes. Puis ajouter un volume équivalent de HBSS pour inactiver le tampon d'hémolyse.Verser la suspension cellulaire dans un filtre cellulaire de 40 micromètres afin d'éliminer les débris et les agrégats cellulaires, en récupérant le filtrat dans un nouveau tube conique de 50 millilitres. Ensuite, à l’aide d’un hémocytomètre, déterminer le nombre de cellules pour les échantillons de poumon et de moelle osseuse. Noter la concentration et le volume total de la suspension cellulaire.Ensuite, faire un culot de la suspension de cellules pulmonaires uniques par centrifugation à 450 RCF pendant 10 minutes. Pour maintenir les cellules, resuspendre simultanément les cellules pulmonaires et celles de la moelle osseuse à raison de 10 puissance six cellules par millilitre dans un DMEM à haute teneur en glucose, supplémenté et préchauffé.Pour colorer l'ADN, ajoutez le colorant HOAXED 33342 à une concentration finale de cinq microgrammes par litre. Ensuite, mélangez les cellules par retournement doux et incubez-les dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant exactement 90 minutes. Puis centrifugez pendant 10 minutes à 450 G à quatre degrés Celsius après la rotation.Procéder à la coloration des tissus pulmonaires et de la moelle osseuse avec l'anticorps anti-CD45 et l'iodure de propidium en vue de leur analyse par cytométrie en flux. Une fois les cellules colorées, conserver les tubes sur de la glace, à l'abri de la lumière, jusqu'à l'analyse par cytométrie en flux. Préparer la cytométrie en flux en s'assurant que les lasers de l'appareil sont alignés et qu'il est configuré pour le tri cellulaire.L'appareil utilisé doit être équipé de lasers bleu à 488 nanomètres, rouge à 635 nanomètres et UV entre 350 et 355 nanomètres, ainsi que de deux détecteurs sur le trajet du laser UV, munis de filtres bleu 45/65 et rouge 675/50. En outre, le détecteur UV-rouge doit présenter une sensibilité élevée pour le signal rouge, et l'appareil doit être équipé d'un système de refroidissement permettant de maintenir l'échantillon à 10 degrés Celsius. Dans le logiciel de l'appareil, configurez des histogrammes pour afficher la diffusion avant linéaire en fonction de la diffusion latérale, ainsi qu'un graphique de discrimination des doublets adapté à l'appareil.Un tracé d'histogramme de l'iodure de propidium (PI) utilisant un signal logarithmique, un nuage de points rouge contre bleu utilisant des signaux linéaires et un tracé d'histogramme de CD45-APC utilisant un signal logarithmique. Une fois que l'appareil est prêt, placer l'échantillon de moelle osseuse marqué dans le port de chargement de l'appareil. Cet échantillon sert de témoin de marquage et de réglage de l'appareil.Commencez à collecter les événements et ajustez les signaux linéaires de diffusion avant. Pour visualiser clairement la population cellulaire, les cellules doivent se situer approximativement au centre inférieur du graphique, la diffusion avant étant en abscisse. Étant donné que la coloration nucléaire PI est perméante à la membrane IMP, elle sera exclue des cellules vivantes.Dessinez une région de sélection sur les cellules mortes positives au PI dans l'histogramme du PI. Indiquez au logiciel de l'appareil de colorer les cellules mortes. Dans cette région, en rouge.Il est utile d'utiliser la coloration des cellules mortes perméabilisées comme guide pour identifier la population hôte G0 G1. La coloration par l'iodure de propidium est également excitée par le laser UV, et la majorité des cellules mortes doivent être en dehors de l'échelle. Sur le côté droit du graphique de fluorescence rouge contre bleue en fausse couleur, la population G0 G1 de la moelle osseuse doit apparaître comme un groupe compact d'événements sur le graphique rouge contre bleu en fausse couleur.Régler les tensions du détecteur afin de positionner l'amas G0-G1 dans le coin supérieur droit du centre du tracé. Une partie de la phase S et l'ensemble de la phase G2 du cycle cellulaire peuvent être hors échelle. Sur le coin supérieur droit du tracé rouge contre bleu trafiqué, la population latérale faible sera visible en train de s'étirer depuis le côté gauche de l'amas G0-G1 jusqu'au coin inférieur gauche du tracé.Tracez maintenant une porte autour de l'amas cellulaire dans le diagramme FSC par rapport à SSC. Représentez graphiquement la population de cellules simples identifiée sur le tracé des doublest et les cellules vivantes sur l'histogramme de PI. Ensuite, configurez le tracé hoax pour afficher uniquement ces populations sélectionnées.Après avoir défini le tracé hôte, dessinez une région autour de la population latérale. Attribuez cette région comme une fenêtre au graphique CD 45 A PC, ainsi qu'aux fenêtres de diffusion latérale des cellules uniques et des cellules vivantes. Maintenant que le système est configuré, retirez l'échantillon du port de chargement et placez l'échantillon pulmonaire dans le port de chargement.Les paramètres de l'instrument ne devraient pas avoir besoin d'être ajustés à nouveau pour cet échantillon. Commencez à collecter les événements sur le graphique rouge contre bleu. L'amas G zéro G un pour l'échantillon pulmonaire apparaît généralement plus allongé dans la direction de l'axe des x et ressemble au symbole tilde sur un clavier.La porte de la population latérale doit être positionnée de manière similaire à celle réglée pour l'échantillon de moelle osseuse. De légers ajustements vers le haut ou vers le bas peuvent être nécessaires afin d'assurer une résolution nette de la population latérale. Maintenir une faible différence de pression pendant le tri en veillant à ce que la vanne d'écoulement de l'échantillon ne soit pas ouverte trop largement.Ensuite, pour isoler les CSM, placez une plaque de collecte de 96 puits dans la chambre de tri et configurez les fenêtres de tri sur l'histogramme CD45 APC afin de séparer les populations positives et négatives. Enfin, récupérez les cellules soit comme une population mixte dans un tube, soit en cellules individuelles pour isoler des clones dans une plaque de 96 puits. Après le tri cellulaire des CSM pulmonaires, les cellules sont ensemencées dans des boîtes de 30 millimètres contenant du milieu AMEM supplémenté avec 20 % de SFB. Premièrement, les cellules triées apparaissent petites, rondes et brillantes après environ deux à trois semaines.Des colonies présentant le phénotype mésenchymateux deviennent visibles et la prolifération est plus évidente pour chaque préparation cellulaire. Évaluer la capacité des CSM pulmonaires à se différencier en lignées mésenchymateuses classiques telles qu'ostéoblastes, adipocytes et chondrocytes, ainsi que leur expression membranaire de marqueurs mésenchymateux reconnus. Réaliser une analyse cytogénétique par banding afin de confirmer l'absence d'anomalies chromosomiques grossières.Après l'isolement par cytométrie en flux et la génération de clones monocellulaires, un test de formation de colonies est réalisé pour caractériser les cellules MSC et leurs capacités de différenciation. Commencez avec des cellules diluées à trois fois 10 puissance quatre cellules par millilitre. Dans des boîtes de 100 millimètres contenant du milieu de culture incomplet, effectuez des dilutions en série de deux, six fois 10 puissance quatre, trois fois 10 puissance quatre, 1,5 fois 10 puissance quatre et 0,75 fois 10 puissance quatre cellules par boîte, dans 10 millilitres de milieu, en triplicata.Ensuite, après 10 jours de culture, placer les plaques dans l'incubateur, éliminer le milieu et rincer les cellules avec du PBS. Puis les fixer en ajoutant du méthanol à 100 % pendant cinq minutes à température ambiante. Après cinq minutes, éliminer le méthanol.Ensuite, pour détecter la formation de colonies, ajoutez de la gza à 0,4 % poids par volume, diluée au 1/20 avec de l'eau ionisée, et incubez de 10 à 15 minutes. Puis, éliminez le colorant par décantation et rincez à l'eau ionisée. Laissez sécher les échantillons à l'air libre et quantifiez le nombre de colonies contenant plus de 25 cellules par colonie à l'aide d'un microscope inversé ou d'une méthode de visualisation. Les colonies sont grandes et composées de quelques centaines de cellules, comme illustré ici, et présentent un phénotype mésenchymateux. Les CSM ont été isolées comme montré dans cette vidéo et mises en culture dans des plaques de 96 puits en conditions de croissance simulée. Des cellules présentatrices d'antigène marquées au CFSE et arrêtées en phase de croissance ont ensuite été ajoutées aux CSM pulmonaires.La prolifération des CSM isolées a ensuite été mesurée par la diminution de l'intensité moyenne de fluorescence du CFSE par rapport au fond, constitué de lymphocytes T marqués au CFSE seuls, comme illustré sur cette figure, en l'absence de SC pulmonaire et en présence de cellules présentatrices d'antigène, les APC, avec ou sans albumine OVA. Les lymphocytes T effecteurs CD40 positifs montrent une diminution de l'intensité de fluorescence du CFSE, ce qui indique une prolifération, entourée en rouge. L'intensité de fluorescence du CFSE au niveau de la membrane des lymphocytes T diminue de façon équitable à chaque division cellulaire, c'est-à-dire de moitié à chaque division. En présence de CSM pulmonaires, APC avec ou sans OVA, les lymphocytes T effecteurs CD40 positifs ne montrent aucun changement significatif de l'intensité du CFSE, ce qui indique une absence de prolifération après leur activation. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie des cellules souches pulmonaires pour explorer le rôle des cellules souches mésenchymateuses dans des maladies pulmonaires telles que l'hypertension artérielle pulmonaire et la fibrose pulmonaire.Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en environ cinq heures en suivant cette procédure. D'autres méthodes, telles que les tests de différenciation, peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires, notamment pour déterminer si les cellules souches mésenchymateuses pulmonaires présumées présentent une différenciation multipotente adéquate, notamment en os, en graisse et en cartilage.

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