Isolement et caractérisation de Hoechst ^Faible CD45 ^Négatifs Souris Cellules souches mésenchymateuses du poumon

Cette vidéo montre un protocole pour l’isolement des cellules souches mésenchymateuses pulmonaires à faible CD 45 négatif de l’hôte. Les cellules souches mésenchymateuses à résonance tissulaire ou CSM sont des régulateurs importants de la réparation ou de la régénération des tissus, de la fibrose, de l’inflammation et de l’angiogenèse. Tout d’abord, les poumons sont disséqués à partir d’une souris sacrifiée.

Le tissu pulmonaire est digéré pour obtenir une suspension unicellulaire. Les cellules sont colorées à l’aide d’une matrice de canular et de CD 45 et triées par cytométrie en flux pour obtenir des CSM pulmonaires de l’hôte à faible teneur en CD 45. Les CSM pulmonaires sont ensuite développées en culture et un test de formation de colonie est effectué pour évaluer les capacités de différenciation des CSM.

D’autres études peuvent ensuite être menées pour examiner le rôle des CSM dans l’homéostasie tissulaire et la maladie. La méthode que nous présentons ici peut être utilisée pour isoler des cellules souches mésenchymateuses pulmonaires de souris ou d’humains et peut être appliquée à cette étude de maladies pulmonaires telles que la fibrose pulmonaire, l’hypertension pulmonaire et la BPCO. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront des difficultés en raison de la variété des méthodes disponibles pour la préparation des tissus, ainsi que de la configuration du cytomètre en flux, des contrôles et des analyses appropriés.

La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car il est difficile de décrire la technique appropriée pour hacher et digérer le tissu pulmonaire pour une viabilité optimale des cellules avec des mots seuls. De plus, la configuration et les analyses de l’instrument de cytométrie en flux sont mieux communiquées par le biais de démonstrations. Commencez ce protocole en retirant les poumons qui seront utilisés pour obtenir des cellules souches mésenchymateuses à partir d’une souris adulte sacrifiée.

À l’aide d’une petite paire de ciseaux bien aiguisés, coupez la cage thoracique latéralement de chaque côté de la souris. Ouvrez la cavité thoracique, puis retirez le diaphragme. Insérez une seringue de 10 millilitres avec une aiguille de calibre 20 et demi dans le ventricule cardiaque droit et appuyez doucement sur le piston pour le perfuser avec trois à cinq millilitres de PBS, en évacuant le sang des poumons.

Ensuite, à l’aide de ciseaux, coupez la trachée et la grosse bronche et jetez-les. Puis à l’aide d’une pince. Ramassez les petits lobes pulmonaires blancs et placez-les dans une boîte de Pétri remplie de solution saline tamponnée de mouchoir ou HBSS.

Retirez ensuite le cœur et séparez les lobes pulmonaires. Répétez ce processus pour toutes les souris de l’étude. Transférez les lobes pulmonaires sur le couvercle du plat.

Humidifiez le tissu avec juste assez de HBSS pour l’empêcher de se dessécher. Ensuite, à l’aide d’un scalpel jetable, hachez les lobes pulmonaires pour obtenir de la moelle osseuse afin d’utiliser le contrôle de maintien pour la cytométrie en flux. Utilisez une paire de ciseaux tranchants pour couper la cheville et le haut du fémur.

Placez le membre dans une nouvelle boîte de Pétri. Coupez ensuite le genou, en laissant un morceau linéaire de fémur et un deuxième morceau contenant le tibia et le péroné. À l’aide d’une pince, retirez le muscle pour révéler le tibia, le péroné et le fémur.

Prenez maintenant une seringue de cinq millilitres avec une aiguille de calibre 26 et demi et insérez l’aiguille dans l’ouverture de la moelle osseuse. À une extrémité du tibia, tenez l’os avec l’autre extrémité dirigée dans un tube conique de 50 millilitres rempli de 15 millilitres de HBSS et appuyez sur le piston pour distribuer le HBSS et rincer la moelle osseuse dans le tube. Répétez ce processus avec un péroné et un fémur.

Colorer la moelle osseuse avec l’hôte 3 3 3 4 2 mourir à une concentration finale de cinq microgrammes par millilitre dans du DMEM supplémenté à haute teneur en glucose. Ensuite, une suspension cellulaire unique de tissu pulmonaire sera générée à partir du tissu isolé. Placez chaque poumon dans un tube contenant 0,2 % de préchauffage.

Préparation dans un HBSS stérile, puis immersion du tube dans un bain-marie à 37 degrés Celsius et incubation pendant 30 minutes. Après l’incubation, utilisez la pipette de 10 millilitres pour tritraire l’échantillon jusqu’à ce que la digestion s’écoule facilement à travers la pipette. Environ 10 répétitions d’incubation pendant 15 minutes supplémentaires, soit 37 degrés Celsius pour terminer la digestion des tissus.

Une fois la digestion terminée, diluez la suspension cellulaire avec du HBSS et utilisez une pipette de cinq millilitres pour tripoter à nouveau afin de disperser les fragments de tissu résiduels. Ensuite, pour éliminer les fragments de tissu non digérés, versez la suspension à travers une crépine à cellules micromolaires de 70 millimètres dans un tube conique de 50 millilitres. Ajouter la suspension petit à petit pour permettre à l’échantillon de s’écouler à travers la crépine de la cellule.

Si des fragments de tissu non digérés bloquent complètement le flux de la suspension cellulaire. Versez à travers une nouvelle passoire cellulaire dans un nouveau tube. Granulez la suspension cellulaire pendant 10 minutes à 450 RCF.

Après le spin, décantez le surnageant et remettez doucement en suspension la pastille cellulaire à température ambiante. Tampon de lyse des globules rouges, incuber à température ambiante pendant cinq minutes. Ajoutez ensuite un volume égal de HBSS pour inactiver le tampon de lyse.

Versez la suspension cellulaire dans une crépine à cellules micromolaires de 40 pour éliminer les débris et les agrégats cellulaires, en recueillant le flux dans un nouveau tube conique de 50 millilitres. Ensuite, à l’aide d’un hémocytomètre, déterminez le nombre de cellules pour les échantillons de poumon et de moelle osseuse. Noter la concentration et le volume total de la suspension cellulaire.

Ensuite, granulez la suspension de cellules pulmonaires uniques par centrifugation à 450 RCF pendant 10 minutes. Pour maintenir les cellules, les cellules pulmonaires et osseuses sont remises en suspension en même temps. 10 à six cellules par millilitre dans le DMEM supplémenté en préchauffage.

Pour colorer l’ADN, ajoutez le colorant HOAXED 3 3 3 4 2 à une concentration finale de cinq microgrammes par litre. Ensuite, mélangez les cellules par inversion douce et incubez dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant exactement 90 minutes. Ensuite, centrifugez pendant 10 minutes à 450 G à quatre degrés Celsius après l’essorage.

Procéder à la coloration des tissus pulmonaires et de la moelle osseuse avec de l’anti CD 45 et de l’iodure de propidium en préparation de l’analyse par cytométrie en flux. Une fois les cellules colorées, conservez les tubes sur de la glace à l’abri de la lumière jusqu’à ce que l’analyse par cytométrie en flux soit effectuée. Préparez-vous à la cytométrie en flux en vous assurant que les lasers des instruments sont alignés et qu’elle est configurée pour le tri cellulaire.

L’instrument utilisé doit être équipé de lasers bleus de 488 nanomètres, rouges de 635 nanomètres et UV de 350 à 355 nanomètres avec deux détecteurs sur le trajet du laser UV avec des filtres bleus 45 sur 65 et rouges 6 75 sur 50. De plus, le détecteur UV rouge doit avoir une sensibilité élevée pour le signal rouge et l’instrument doit être équipé d’une unité de refroidissement pour maintenir l’échantillon à 10 degrés Celsius. Dans le logiciel de l’instrument, configurez des tracés d’histogramme pour afficher la diffusion linéaire vers l’avant ou latérale, un tracé de discrimination doublet approprié pour l’instrument.

Un graphique d’histogramme de PI à l’aide d’un signal log, une côte rouge par rapport à une côte bleue à l’aide de signaux linéaires et un graphique d’histogramme de CD 45 A PC à l’aide d’un signal log. Une fois l’instrument prêt, placez l’échantillon de moelle osseuse colorée dans l’orifice de chargement de l’instrument. Cet échantillon est utilisé comme contrôle de la coloration et de la configuration de l’instrument.

Commencez à collecter des événements et ajustez les signaux linéaires de diffusion vers l’intérieur. Pour visualiser clairement la population cellulaire, les cellules doivent se trouver approximativement au centre inférieur de la dispersion vers l’avant du graphique en tant qu’axe x. Étant donné que la coloration nucléaire PI est imprégnée d’une membrane IMP, elle sera exclue des cellules vivantes.

Dessinez une région de marche sur les cellules mortes PI positives dans l’histogramme PI. Demandez au logiciel de l’instrument de colorer les cellules mortes. Dans cette porte rouge.

Il est utile d’utiliser les cellules mortes ventilées de couleur comme navigateur pour identifier la population de l’hôte G zéro G un. La coloration PI est également excitée par le laser UV et la majorité des cellules mortes doivent être hors échelle. Sur le côté droit du graphique de fluorescence du canular rouge par rapport au bleu, la population G zéro G un de la moelle osseuse doit être considérée comme un groupe serré d’événements dans le graphique du canular rouge par rapport au bleu.

Ajustez les tensions du détecteur pour placer le groupe G zéro G un en haut à droite du centre sur le graphique. Une partie de la phase S et l’ensemble des G deux du cycle cellulaire peuvent être hors échelle. En haut à droite du graphique canular rouge ou bleu, la population latérale accueille Low sera visible à partir du côté gauche de l’amas G zéro G un jusqu’au coin inférieur gauche du graphique.

Tracez maintenant une porte autour de l’amas de cellules dans le FSC par rapport au SSC. Tracez la population singulet identifiée dans le graphique doublet et les cellules vivantes dans l’histogramme PI. Attribuez ensuite le graphique de canular pour n’afficher que ces populations fermées.

Après avoir délimité la parcelle hôte, dessinez une région autour de la population latérale. Attribuez cette région en tant que porte à l’histogramme PC du CD 45 A, ainsi qu’au singulet de diffusion de la lumière et aux portes des cellules vivantes. Maintenant que le système est installé, retirez l’échantillon de l’orifice de chargement et placez l’échantillon pulmonaire dans l’orifice de chargement.

Il ne devrait pas être nécessaire d’ajuster à nouveau les paramètres de l’instrument pour cet échantillon. Commencez à collecter des événements sur le complot de canular rouge contre bleu. Le groupe G zéro G un pour l’échantillon pulmonaire apparaît généralement plus allongé dans la direction de l’axe x et ressemble au symbole tilda sur un clavier.

Le canular de marche de la population latérale basse doit être dans une position similaire à celle définie pour l’échantillon de moelle osseuse. Ces légers ajustements vers le haut ou vers le bas peuvent être nécessaires pour assurer une résolution serrée de la population latérale. Maintenez une faible différence de pression pendant le tri en vous assurant que la vanne de débit de l’échantillon n’est pas trop ouverte.

Ensuite, pour isoler MSC, placez une plaque de collecte de 96 puits dans la chambre de tri et installez les portes de tri sur l’histogramme PC CD 45 A pour séparer la population positive et négative. Enfin, collectez les cellules sous forme de population mixte dans un tube ou de cellules uniques pour isoler les clones dans une plaque de 96 puits après la collecte des CSM pulmonaires par tri cellulaire, les cellules sont plaquées dans des boîtes de 30 millimètres à l’aide d’un MEM complété par 20 % de FBS. Tout d’abord, les cellules triées apparaissent petites, rondes et brillantes après environ deux à trois semaines.

Les colonies avec le phénotype mésenchymateux deviennent évidentes et la prolifération est plus évidente pour chaque préparation cellulaire. Évaluer la capacité des CSM pulmonaires à se différencier en lignées mésenchymateuses traditionnelles d’ostéoblastes, d’adipocytes et de chondrocytes et leur expression à la surface cellulaire des marqueurs mésenchymateux acceptés. Effectuer une analyse de bannissement cytogénétique pour confirmer l’absence d’anomalies chromosomiques macroscopiques.

Après l’isolement par cytométrie en flux et la génération de clones de cellules uniques, un test de formation de colonies est effectué pour caractériser les cellules MSC et les capacités de différenciation. Commencez avec des cellules diluées à trois fois 10 des quatre cellules par millilitre. Milieu cul incomplet dans des boîtes de 100 millimètres, effectuez une dilution des céréales deux, six fois 10 sur quatre, trois fois 10 sur quatre, 1,5 fois 10 sur quatre et 0,75 fois 10 sur quatre cellules par boîte dans 10 millilitres de milieu en trois exemplaires.

Placez ensuite les plaques dans l’incubateur après 10 jours de culture, videz le milieu et rincez les cellules avec du PBS. Ensuite, fixez-les en ajoutant 100 % de méthanol pendant cinq minutes à température ambiante. Au bout de cinq minutes, videz le méthanol.

Ensuite, pour détecter la formation de colonies, ajoutez 0,4 % en poids par volume de gza dilué un à 20 avec l’eau ionisée et incuber pendant 10 à 15 minutes. Versez ensuite la tache et rincez à l’eau ionisée. Laissez les échantillons sécher à l’air libre et quantifiez le nombre de colonies contenant plus de 25 cellules par colonie à l’aide d’un microscope inversé ou d’une visualisation.

Les colonies sont grandes et composées de quelques centaines de cellules, comme le montre ici, et présentent un phénotype mésenchymateux. Les MSC ont été isolées comme le montre cette vidéo et plaquées dans des plaques de 96 puits simulant la croissance. Des cellules présentatrices d’antigènes marquées au CFSE arrêtées ont ensuite été ajoutées aux CSM pulmonaires.

La prolifération des CSM isolées a ensuite été mesurée comme la diminution de l’intensité moyenne de fluorescence de CFSE par rapport au bruit de fond, qui était des cellules T marquées CFSE seules comme le montre cette figure, en l’absence de CS pulmonaire et de présence de cellules présentatrices d’antigènes, Une cellule T efficace positive PC plus O albumine CD 40 démontre une diminution de l’intensité de CFSE, ce qui indique une prolifération entourée en rouge. L’intensité de fluorescence CFSE de la membrane des lymphocytes T diminue économétriquement à chaque division cellulaire, c’est-à-dire la moitié à chaque division en présence de lymphocytes T affectés positifs M-S-C-A-P-C plus moins OVA CD-40 Les lymphocytes T affectés ne présentent aucun changement significatif de l’intensité CFSE, ce qui indique un manque de prolifération après son développement. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie des cellules souches pulmonaires pour explorer le rôle des cellules souches mésenchymateuses dans les maladies pulmonaires telles que l’hypertension artérielle pulmonaire et la fibrose pulmonaire.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en environ cinq heures Suite à cette procédure. D’autres méthodes, comme les tests de différenciation, peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires, notamment si les cellules souches mésenchymateuses pulmonaires présumées présentent ou non une différenciation multi-lignées appropriée, un potentiel pour la graisse osseuse et le cartilage.