Concentration des métabolites issus de communautés planctoniques à faible densité de l'environnement en utilisant métabolomique résonance magnétique nucléaire

La spectroscopie par résonance magnétique nucléaire offre plusieurs avantages distincts pour la recherche en métabolomique environnementale, mais présente une sensibilité relativement faible dans cette procédure. Une méthode de filtration permettant la concentration et l'extraction de métabolites provenant de communautés entières à partir de systèmes planctoniques, adaptée à la RMN, est décrite. Cette approche est réalisée en préparant tout d'abord spécialement les filtres destinés à la collecte des échantillons, en éliminant les substances extractibles.

La deuxième étape de la procédure consiste à filtrer l'échantillon, naturel ou expérimental, sur les filtres. La troisième étape de la procédure est de lyophiliser le matériau échantillonné et d'extraire les métabolites. La dernière étape de la procédure consiste à analyser les échantillons par spectroscopie de résonance magnétique nucléaire et à intégrer les données de manière appropriée.

En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus qui montrent les changements métaboliques dans des échantillons naturels le long de gradients environnementaux ou en réponse à des manipulations expérimentales, grâce aux approches de métabolomique et de transams. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme la centrifugation, est que l'ensemble de la communauté peut être échantillonné et que des volumes d'échantillons plus grands sont possibles pour les échantillons de faible densité. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l'écotoxicologie des métaux, telles que la manière dont la croissance microbienne réagit aux changements environnementaux. La démonstration de la procédure sera assurée par Stage et From de mon laboratoire.

Commencez ce protocole en plaçant les filtres dans un bécher Pyrex propre de 500 millilitres à l’aide de pinces. Recouvrez les filtres d’eau distillée pour effectuer un prélavage, agitez bien afin d’éviter que les filtres ne collent entre eux. Versez l’eau et répétez le rinçage deux fois.

Après le dernier rinçage, ajouter 300 millilitres d'eau Milli Q dans le bécher et stériliser les filtres en autoclave. Une fois les filtres stérilisés en autoclave, verser l'eau Milli Q et rincer trois fois les filtres comme précédemment, en utilisant cette fois de l'eau Milli Q.

Placer les filtres individuels sur une surface propre et sèche, comme du papier d'aluminium, à l'aide de pinces, et les faire sécher à une température raisonnable. Par exemple, à 37 degrés ou à l'air, les filtres sont désormais prêts à être utilisés pour la démonstration de ce protocole. Un collecteur de filtration en acier inoxydable Millipore à trois postes, équipé de colonnes de filtration microanalytiques de 25 millimètres avec supports en verre et d'une pompe mécanique, est utilisé selon une technique aseptique.

Placer un seul filtre de 25 millimètres sur la base de la colonne de filtration. Appliquer la colonne et fixer l'appareil avec une pince. Charger 15 millilitres d'échantillon ici obtenus à partir d'un microcosme riche en nutriments dans la colonne.

Ouvrir la vanne d'arrêt du collecteur de filtration et mettre en marche la pompe de filtration sous une pression douce afin de minimiser la rupture des cellules. Pour les échantillons de faible densité, des ajouts successifs d'eau peuvent être nécessaires. Veiller à ne pas laisser le filtre s'assécher pendant une période prolongée entre les ajouts d'eau.

Deuxièmement, réduire les sels paramagnétiques résiduels provenant des échantillons marins et effectuer un rinçage facultatif à l'eau douce. Une fois le filtrage terminé, éteindre la pompe et laisser la vanne ouverte afin de maintenir une pression négative sous le filtre. Retirer la pince et la colonne de filtration d'une seule main.

Utilisez des pinces propres pour saisir le filtre. Repliez le filtre sur lui-même sans faire de pli à l'aide de l'autre main. Utilisez le bord d'un tube stérile de microcentrifugation de deux millilitres pour maintenir le filtre en place.

Placez le filtre dans le tube de deux millilitres et relâchez-le afin qu’il s’ouvre avec le côté échantillon tourné vers l’intérieur. Congelez immédiatement dans l’azote liquide pour extraire les métabolites solubles dans l’eau. Réhydratatez d’abord les échantillons toute la nuit ou pendant au moins 10 heures après lyophilisation, puis ajoutez un broyeur en acier inoxydable à chaque tube.

Ajouter 750 microlitres de tampon phosphate de potassium standardisé et d'oxyde de deutérium contenant l'étalon DSS. Soniquer les échantillons pendant cinq minutes à quatre degrés dans un bain de sonication à eau afin d'éliminer le matériel cellulaire du filtre. Retirer les filtres à l’aide de pincettes propres.

Disruptez les cellules à l’aide d’un broyeur à billes à 1600 tr/min pendant cinq minutes. Incubez ensuite à 65 degrés Celsius. Agitez par secouage sur un agitateur de laboratoire pendant 15 minutes.

Après l'incubation, retirez le broyeur métallique à l'aide de pinces propres. Centrifugez l'échantillon à 13 000 ×g pendant cinq minutes. Après la centrifugation, aspirez le surnageant et transférez-le directement dans un tube RMN pour la spectroscopie par RMN.

Chargez l'échantillon dans le spectromètre RMN ici. Les échantillons sont analysés sur un spectromètre Bruker DRX 500 équipé d'une sonde TXI avec gradient triaxial, fonctionnant à 298 Kelvin. Verrouillez, accordez et corrigez l'aimant.

Obtenir des spectres RMN du proton 1D à l'aide de l'interface Top Spin et des méthodes décrites précédemment, ou utiliser un autre logiciel d'interface de spectromètre selon les besoins. Ici, les spectres ont été enregistrés avec suppression des signaux résiduels de l'eau par la séquence d'impulsions Watergate, avec un temps de répétition de 1,2 seconde. Dans le présent exemple, 128 transitoires ont été collectés pour chaque échantillon.

Transférez les répertoires de données RMN vers un ordinateur personnel disposant du logiciel NMR pipe. Traitez les données brutes, définissez le signal du DSS comme référence à zéro ppm, puis phasez manuellement les spectres. Numérisez les données spectrales par bacs ici en utilisant le package FT two B disponible publiquement sur le site web de commerce électronique.

D'autres utilitaires logiciels tels que RNMR ou Atomics peuvent également être utilisés pour le binning. Les données peuvent être normalisées par rapport au signal total ou au signal DSS afin de montrer les variations proportionnelles des signaux entre les échantillons. Les données obtenues peuvent désormais être utilisées pour des analyses statistiques ultérieures, telles qu'une analyse en composantes principales ou PCA, à l'aide de logiciels libres comme R, comme illustré.

Voici un exemple de spectres RMN du proton obtenus à l'aide de la procédure démontrée. Les spectres proviennent de deux points temporels d'une expérience en microcosme et montrent des différences nettes dues aux activités métaboliques des algues. Le spectre du jour quatre présente une abondance considérable de pics, particulièrement dans la plage de 3 à 4:00 PM, par rapport à l'échantillon du jour un.

Ces pics peuvent être attribués aux sucres produits par la floraison de diatomées à l'intérieur du microcosme. Dans une expérience similaire, un graphique des scores de l'ACP dérivé de l'inflexion des M. Spectra, montrant les deux premières composantes principales, a été utilisé pour comparer la croissance de communautés planctoniques naturelles dans de l'eau de mer artificielle et naturelle. Cette approche statistique permet de réduire des données multidimensionnelles à un format plus simple, ici bidimensionnel, et de révéler simplement la structure parmi les points de données sous-jacents proches les uns des autres.

Chaque axe ou les deux sont plus similaires ici. Des différences métaboliques nettes entre les deux traitements peuvent être observées. Les données de cette expérience ont été utilisées pour effectuer une analyse multi-omique.

La combinaison de la RMN avec les données génomiques sur la composition des communautés, fondée sur l'électrophorèse en gradient dénaturant des gènes 18S et 16S d'ARNr, révèle également des profils microbiens distincts entre les microcosmes d'eau de mer naturelle et artificielle. Cette concordance entre le métabolome et le génome dans les systèmes naturels démontre l'utilité de cette approche. Lors de la mise en œuvre de cette procédure, il est essentiel de veiller à appliquer une technique appropriée afin de minimiser la contamination lors du suivi de cette procédure.

D'autres méthodes, telles que l'analyse de la création à l'aide de niveaux omiques, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme la manière dont le microbiome est corrélé à certains métabolites.