Visualisation virus de la dengue grâce à Alexa Fluor Étiquetage

L’objectif général de cette expérience est de marquer par fluorescence le virus de la dengue pour des études microscopiques. Préparez les tampons nécessaires et purifiez le virus de la dengue avec un coussin de saccharose, reconstituez le colorant de flux Amy React Alexa et le virus de la dengue dans le tampon d’étiquetage. Étiquetez le virus de la dengue avec une centaine de micromolaires de flux Alexa.

Mourir pendant une heure et arrêter la réaction de marquage avec le sous-réactif. Purifier l’étiquette du virus de la dengue à l’aide d’une colonne d’exclusion de taille. Retitrez le virus marqué par dosage en plaque et estimez le degré de marquage par dosage par immunofluorescence.

Bonjour, je suis Sam Jang des laboratoires nationaux du DSO et je travaille dans le laboratoire du Dr Wee dans le programme des maladies infectieuses émergentes après l’école supérieure de médecine de la NUS. Aujourd’hui, je vais vous montrer comment marquer par fluorescence le virus Denki avec le colorant antigrippal Amy Reactive Alexa pour des études d’imagerie. Alexa, la grippe meurent, ont une stabilité supérieure et sont moins sensibles au pH que les régimes courants tels que la fluorescéine et la rumine, ce qui les rend idéaux pour les études sur l’absorption cellulaire et le transport endosomal du virus.

Le virus de la dengue marqué par le défaut Alexa facilitera la compréhension de la pathogenèse de la dengue. Alors commençons. Avant la réaction d’étiquetage, préparer un nouveau tampon d’étiquetage et un réactif d’arrêt conformément au protocole écrit et purifier le virus de la dengue par un coussin de saccharose, ajouter le volume approprié du virus de la dengue purifié au tampon de marquage dans un microtube à centrifuger pour atteindre une concentration de 300 millions d’unités formant par millilitre.

Celle-ci peut être augmentée proportionnellement. Pour l’étiquetage par lots des virus. Reconstituez le colorant de sol Alexa lyophilisé à un millimolaire dans le tampon d’étiquetage juste avant la réaction de marquage.

Minimisez l’exposition à la lumière à partir de cette étape. À des fins de démonstration, le colorant pour sol Alexa sera laissé sans protection contre la lumière 800 microlitres d’un millimolaire. Alexa flow meurt au virus de la dengue dilué tout en remuant doucement avec la pointe de la micro Pipet.

Incuber pendant une heure à température ambiante à l’abri de la lumière mélangée par de douces inversions toutes les 15 minutes après une heure, Centrifuger brièvement les tubes. Un 800 microlitres de la sous-région tout en regardant doucement avec la micro pipette incuber pendant une heure supplémentaire à température ambiante. Protégé de la lumière par de douces inversions toutes les 15 minutes.

Entre-temps, il assimile la colonne de purification à 25 millilitres de tampon HNE. Après l’incubation d’une heure, appliquez le virus étiqueté dans la colonne et commencez à collecter le flux. Remplissez la colonne avec la mémoire tampon HNE.

Une fois que tout le virus marqué est entré dans la matrice, jetez les premiers 2,5 millilitres de flux et récupérez les deux millilitres suivants de la fraction virale marquée. Ecor et a vu le virus étiqueté purifié à moins 80 degrés Celsius. Déterminer le titre du virus étiqueté par dosage sur plaque.

Dans une expérience typique, il faut observer une baisse de moins de dix fois du titre du virus. Après le marquage, un test d’immunofluorescence doit être effectué pour évaluer le degré de marquage. Pour ce faire, énumérez les cellules virales à l’aide d’un hémocytomètre et d’un volume approprié de cellules par rapport au milieu de croissance pour obtenir une densité de 50 000 cellules par millilitre.

Voir un millilitre de cellules virales par puits dans une plaque à quatre puits contenant un couvercle en verre stérile. Dormir. Incuber les cellules pendant la nuit à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone. Retirez la plaque de l’incubateur et aspirez le supinateur à partir de bien en fait, les cellules avec environ un MOI du virus marqué dans un volume de cent microlitres pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius.

Retirez l’inoculum et lavez les cellules avec 0,5 millilitre de tampon PBS par puits. Spirit diss et répète cette procédure deux fois de plus. Fixez les cellules avec 200 microlitres de 3 % par puits à hauteur multiple à température ambiante pendant 30 minutes.

Lavez les cellules trois fois avec 0,5 millilitre de tampon PBS par puits. Aliser les cellules avec une solution d’isation à température ambiante pendant 30 minutes. Retirez la couverture du sommeil à l’aide d’une pince fine.

Vidangez l’excès de liquide en DPant le bord du couvercle. Glisser contre un papier blanc. Placez le côté cellule du couvercle.

Dormez avec 25 microlitres d’anticorps anti-dengue sur un morceau de parfum. Incuber pendant une heure dans une chambre humide à température ambiante à l’abri de la lumière. Ensuite, transférez la lamelle sur une plaque à six puits et ajoutez deux millilitres de tampon de lavage par huile.

Aspirez le supinate. Répétez ces étapes de lavage deux fois de plus après le dernier lavage. Retirez la lamelle du puits à l’aide de fine fp.

Égouttez l’excès de liquide en trempant le bord du couvercle. Glissez-le contre une lingette en papier. Placez le côté cellule du couvercle.

Dormez sur 25 microlitres d’Alexa au sol pour huit huit anticorps secondaires anti-souris sur un morceau de parfum. Incuber pendant 45 minutes dans une chambre humide à température ambiante à l’abri de la lumière une fois l’incubation terminée, transférer le couvercle de sommeil sur une plaque à six puits et laver les cellules trois fois avec deux millilitres de tampon de lavage Pour chaque lavage après le dernier lavage. Retirez la lamelle du puits et rincez une fois dans l’eau ionisée.

Égouttez l’excès de liquide en le trempant contre un papier. Essuyez la glissière de montage sur une lampe de microscope avec huit microlitres de solution de montage douce. Laissez la solution de montage régler l’air de la nuit à quatre degrés Celsius.

L’échantillon est maintenant prêt à être visualisé avec un microscope fluorescent ou confocal. Placez une petite goutte d’huile d’immersion sur la surface du couvercle et fixez le microscope. Glisser vers la platine du microscope.

Ajustez la platine jusqu’à ce que l’objectif du microscope entre en contact avec l’huile d’immersion. Pour une image claire, éteignez les lumières ambiantes à l’aide du logiciel Zes Zen. Cliquez sur le robinet oculaire pour observer directement l’échantillon à travers l’oculaire du microscope.

Trouvez un remplissage avec des cellules et ajustez la mise au point. Passez maintenant en mode acquisition. Pour minimiser la diaphonie entre les chutes florales, sélectionnez des pistes distinctes pour les étages 4, 8, 8 et quatre.

Acquisitions de colorants et de réglages pour l’excitation et la détection séquentielles. Ajustez le gain et le décalage de la puissance du laser pour vous assurer que l’image n’est pas surexposée ou sous-exposée. Capturez l’image et analysez une zone d’intérêt à l’aide de la fonction de colocalisation.

Le coefficient de chevauchement peut être utilisé pour estimer le degré de marquage du virus de la dengue par le colorant Alexa Flo. Un simple test d’immunofluorescence a été effectué sur des cellules virales et le degré de marquage peut être estimé à partir de la colocalisation du virus marqué Avec une protéine anti e, la coefficience de chevauchement de coloration anti-anticorps varie de 0,65 à 0,8, ce qui suggère qu’environ 65 à 80 % des variances ont été marquées avec le colorant de sol Alexa. Pour que la procédure d’étiquetage soit réussie, il est important de préparer le tampon d’étiquetage et de commencer à faire rage et de reconstituer la digestion au sol Alexa avant l’étiquetage.

La concentration de colorant à utiliser peut être optimisée en fonction de vos besoins. Cette méthode de marquage horizon du virus de la dengue peut potentiellement être adaptée pour marquer d’autres virus. Donc c’est tout.

Merci d’avoir regardé et bonne chance pour votre expérience d’étiquetage.