Méthylation de l'ADN: bisulfite de modification et d'analyse

L’objectif global de cette procédure est de permettre l’analyse de la méthylation de l’ADN des dinucléotides CPG par séquençage génomique de l’ADN converti au sulfite. Ceci est accompli en dénaturant d’abord l’ADN double brin, afin que la réaction de conversion au bisulfite puisse avoir lieu. La deuxième étape consiste à convertir toutes les cytosines non méthylées de l’ADN génomique en uracile par désamination de bisulfite.

Cette réaction comporte trois phases. La première est la sulfatation du résidu de cytosine par l’ajout de sulfite B à la double liaison cinq six. Deuxièmement, la désamination hydraulique de la cytosine par le dérivé du sulfite produit un SSL par le dérivé du sulfite, et troisièmement, l’élimination du groupe sulfonate par traitement alcalin entraîne un résidu SSL.

Ensuite, la région cible est amplifiée par des amorces spécifiques de conversion au bi-sulfite et une amplification PCR. La dernière étape est le clonage et le séquençage du produit de PCR afin d’obtenir une résolution nucléotidique unique pour la méthylation à travers la molécule d’ADN. En fin de compte, les résultats montrent la méthylation de l’ADN des dinucléotides CPG dans l’ADN génomique en exploitant la sensibilité accrue des cytokines par rapport à la désamination de cinq méthylcytosine à bi sulfate dans des conditions acides.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes comme l’analyse sanguine du sud est qu’elle peut permettre la résolution d’un seul nucléotide de la méthylation d. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’épigénétique, telles que le rôle de la méthylation de l’ADN dans les maladies humaines comme le cancer. Pour préparer des échantillons d’ADN pour la conversion du bisulfite, incubez d’abord deux microgrammes d’ADN génomique avec du bisulfite, un tampon de lyse de l’ADN et un volume total de 18 microlitres pendant une heure à 37 degrés Celsius.

Ensuite, dénaturez l’ADN génomique en ajoutant deux microlitres d’hydroxyde de sodium à trois molaires fraîchement préparés à une concentration finale de 0,3 molaire. Incuber les échantillons à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes dans un bain-marie, suivi d’une incubation à 90 degrés Celsius pendant deux minutes. Dans un bloc thermique, placez immédiatement les tubes sur de la glace pendant cinq minutes, centrifugez les tubes pendant 10 secondes à 10 000 G pour vous assurer que l’ADN est au fond du tube, les échantillons d’ADN dénaturé sont maintenant prêts pour la désamination de combat des lymphocytes B, qui sera démontrée ensuite.

Avant les réactions de sulfatation et de désamination hydrolytique, préparer des solutions fraîches de quinol 10 millimolaires et de méta sodium saturé par le sulfite pH 5,0. Comme le méta sulfite de sodium est une solution saturée, de petits grumeaux peuvent rester non dissous. Ajouter le sodium meta par sulfite 208 microlitres et le quinol 12 microlitres au dénaturation de l’ADN 20 microlitres dans un volume final de 240 microlitres.

Agitez les tubes et centrifugez pendant 10 secondes pour vous assurer que toutes les gouttelettes se trouvent au fond du tube. Recouvrir les échantillons d’huile minérale. Incuber les échantillons à 55 degrés Celsius dans un bain-marie pendant quatre à 16 heures, selon la quantité et la qualité de l’ADN à convertir.

Il est important que la conversion du bisulfite ait lieu dans l’obscurité pour éviter l’oxydation. À la fin du temps d’incubation approprié, faites tourner brièvement les tubes dans une microcentrifugeuse pour vous assurer que tout le liquide se trouve au fond du tube. Ensuite, pipetez soigneusement la solution d’ADN du fond du tube sans prélever d’huile minérale.

Pour les prochaines étapes, notre laboratoire utilise le système de nettoyage de l’ADN promega wizard. Ajoutez un millilitre de résine aux échantillons d’ADN, retournez le tube pour mélanger, puis pipetez la solution dans une seringue attachée à une colonne de dessalage. Enfin, pour éliminer tous les ions bi sulfite libres, faites passer l’ADN traité au bi sulfite à travers la colonne de dessalage et ajoutez 50 microlitres d’eau Milli Q.

L’étape suivante consiste à retirer le grenier au bisulfite de l’anneau d’uracile par dessalement. Pour ce faire, ajoutez 5,5 microlitres d’hydroxyde de sodium à trois molaires fraîchement préparé à chaque échantillon d’ADN traité au bisulfite pour une concentration finale de 0,3 molaire. Ensuite, incubez les échantillons à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes.

Centrifugez brièvement les échantillons, puis ajoutez un microlitre d’ARNt à chaque échantillon. Neutralisez la solution en ajoutant de l’acétate d’ammonium à une concentration finale de trois molaires. Ensuite, l’éthanol précipite l’ADN.

Ajouter de la glace froide, 100 % éthanol 330 microlitres et bien mélanger par inversion. Laisser à moins 20 degrés Celsius pendant une heure pour centrifuger toute la nuit à 14 000 GS pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius. Ensuite, éliminez toute trace de surnageant et séchez l’ADN précipité à l’air libre pendant environ 20 minutes.

Après le séchage à l’air, il est presque impossible de voir la pastille d’ADN remettre en suspension dans 50 microlitres de 0,1 XTE ou laisser l’eau à température ambiante pendant environ deux heures pendant ce temps, parfois, vortex les tubes pour s’assurer que l’ADN est dissous, suivi d’une centrifugeuse rapide. Une fois l’ADN dissous, il peut être stocké à moins 20 degrés Celsius pendant un à 10 ans, selon la quantité et la qualité de l’ADN, ou être utilisé immédiatement. Pour l’amplification PCR, l’optimisation de l’amorce est l’aspect le plus difficile de cette procédure.

Par conséquent, les directives suivantes sont fournies pour aider à assurer le succès de la conception de l’amorce. Pour illustrer ces directives, la séquence cible a été convertie par sulfite de sorte que lorsque les cytosines converties sont écrites, elles apparaissent sous forme de T bleus et les sites CPG non convertis apparaissent sous forme de rouges, les amorces doivent avoir une longueur de 24 à 30 paires de bases pour garantir la spécificité. Les amorces doivent avoir une TM prédite similaire supérieure à 50 degrés Celsius et ne pas différer de plus d’un à deux degrés Celsius.

Les amorces doivent contenir plusieurs bases d’environ 25 % C à T pour assurer la spécificité de la conversion. La base finale selon laquelle les trois extrémités premières doivent être un C à T pour assurer l’amplification des dinucléotides D-N-A-C-P-G convertis doit être évitée dans la séquence d’amorces afin d’éviter un biais potentiel vers des matrices méthylées, non méthylées ou non converties. Cependant, si cela est inévitable, la cytosine dans le site CPG doit être remplacée par un Y pour aider à assurer une amplification non biaisée de l’ADN converti.

Enfin, concevez des ensembles d’amorces imbriquées ou semi-imbriquées pour garantir la spécificité ou la sensibilité de la réaction PCR si nécessaire. Préparez des mélanges réactionnels d’amplification PCR dans des aliquotes de 25 microlitres pour l’optimisation. Chaque réaction contient par sulfite de l’ADN génomique converti en sulfite, des amorces DPS, du chlorure de magnésium, du chlorure de potassium, du chlorhydrate de tris, un pH 8,3, une anac polymérase pour tester le biais d’amplification du matériel méthylé ou non méthylé.

Utilisez un échantillon témoin 50 50 50 méthylé non méthylé entièrement converti au bi sulfite pour tester l’amplification proportionnelle par PCR avec conversion au bi sulfite. Des amorces spécifiques et un mélange de réaction PCR dans un thermocycleur à gradient de température définissent la réaction de fonctionnement dans un gradient de plus ou moins trois degrés Celsius par rapport à la TM de l’amorce sur huit à 10 tubes, tourbillonnent les tubes et tournent brièvement dans une micro-centrifugeuse avant de les placer dans le thermocycleur. Cette figure montre un gel agros avec un profil d’amplification PCR à gradient de température à partir d’un mélange de 50 % d’ADN méthylé et non méthylé.

Les amplicons PCR et les voies marquées des voies T deux, cinq et huit ont été traités avec une enzyme de restriction qui ne digérera que l’ADN méthylé Les conditions optimales d’amplification PCR devraient amplifier les amplicons méthylés et non méthylés en proportion et sans biais, ce qui permet d’obtenir une quantité égale de produit PCR coupé et non coupé, comme on le voit ici. Les conditions optimales de thermocyclage pour l’amplification non biaisée sont de 55,6 degrés Celsius. La conversion complète de l’ADN du bisulfite peut être analysée par digestion avec une enzyme spécifique du site de cytosine qui ne digérera que les voies d’ADN non converties trois, six et neuf.

La conversion complète de l’ADN bisulfite est indiquée ici par l’absence d’ADN coupé dans les trois voies, les voies trois, six et neuf. Ce graphique de dissociation en temps réel montre une proportion égale d’ADN méthylé et non méthylé : mélange de raies rouges et oranges 50 50 par rapport à l’amplification de contrôle de raies roses m entièrement méthylées et d’ADN non méthylés, raie verte U, qui se dissocient respectivement à 82,9 degrés Celsius et 86,9 degrés Celsius. Cela indique qu’il n’y a pas de biais d’amplification basé sur la température à laquelle les différentes molécules vont se dissocier.

Les fragments de PCR résultant de l’amplification d’échantillons traités au bisulfite peuvent être visualisés par électrophorèse sur gel agros et séquencés. Directement illustré ici, une trace de séquence de trois lignées cellulaires différentes avec des sites CPG mis en évidence en jaune : la lignée cellulaire X affiche une méthylation de 100 % sur les trois sites CPG, où les lignées cellulaires Y et Z présentent différents degrés de méthylation, comme le montrent les signaux GA superposés illustrés ici. La figure quatre A est une trace de séquence de trois lignées cellulaires différentes avec les sites CPG surlignés en jaune.

Après le séquençage direct des clones individuels, l’état de méthylation des molécules individuelles peut être tabulé dans une carte de bisulfite. Pour visualiser l’hétérogénéité de méthylation, la densité de méthylation aux sites CPG individuels est indiquée en rouge. Dans cette carte représentative des bi sulfites, analyse quantitative de méthylation à haut débit d’un échantillon.

L’utilisation de la technologie de type épi de séquenome peut produire un spectre spécifique dépendant de la présence de cytosines méthylées, comme le montre cet exemple Figure cinq A.Un résumé des ratios dans l’échantillon peut ensuite être extrapolé sous la forme d’une épigramme Figure cinq B.Cet exemple montre le pourcentage de méthylation de l’ADN à chaque site CPG pour quatre lignées cellulaires différentes. Enfin, un résumé du graphique de méthylation figure cinq C peut être dérivé de l’épigramme Après son développement. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de l’épigénétique pour explorer la méthylation de l’ADN et son rôle dans les maladies humaines.