Méthylation de l'ADN: bisulfite de modification et d'analyse

L'objectif général de cette procédure est de permettre l'analyse de la méthylation de l'ADN au niveau des dinucléotides CPG par séquençage génomique de l'ADN converti au bisulfite. Cette analyse est réalisée en deux étapes : premièrement, la dénaturation de l'ADN double brin afin que la réaction de conversion au bisulfite puisse avoir lieu ; deuxièmement, la conversion de toutes les cytosines non méthylées de l'ADN génomique en uracile par désamination au bisulfite.

Cette réaction comprend trois phases. La première est la sulfatation du résidu de cytosine par l'ajout de bisulfite à la double liaison cinq-six. Deuxièmement, la déamination hydrolytique de la cytosine par un dérivé du bisulfite produit un SSL par un dérivé du bisulfite, et troisièmement, l'élimination du groupe sulfonate par un traitement alcalin conduit à un résidu SSL.

Ensuite, la région cible est amplifiée à l'aide d'amorces spécifiques à la conversion au bisulfite et par amplification PCR. La dernière étape consiste en le clonage et le séquençage du produit PCR afin d'obtenir une résolution au niveau du nucléotide unique pour la méthylation le long de la molécule d'ADN. Finalement, les résultats montrent la méthylation de l'ADN au niveau des dinucléotides CpG dans l'ADN génomique, en exploitant la sensibilité accrue de la cytosine par rapport à la 5-méthylcytosine à la déamination par le bisulfite dans des conditions acides.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que l'analyse de Southern, est qu'elle permet une résolution au niveau du nucléotide unique de la méthylation de l'ADN. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l'épigénétique, comme le rôle de la méthylation de l'ADN dans des maladies humaines telles que le cancer. Pour préparer les échantillons d'ADN en vue de la conversion au bisulfite, incubez d'abord deux microgrammes d'ADN génomique avec du bisulfite, du tampon de lyse de l'ADN et un volume total de 18 microlitres pendant une heure à 37 degrés Celsius.

Ensuite, dénaturer l'ADN génomique en ajoutant deux microlitres de soude fraîchement préparée à trois molaire pour obtenir une concentration finale de 0,3 molaire. Incuber les échantillons à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes dans un bain-marie, puis les incuber à 90 degrés Celsius pendant deux minutes. Dans un bloc chauffant, placer immédiatement les tubes sur de la glace pendant cinq minutes, puis centrifuger les tubes pendant 10 secondes à 10 000 G afin de s'assurer que l'ADN se trouve au fond des tubes. Les échantillons d'ADN dénaturé sont désormais prêts pour la désamination des cellules B, ce qui sera démontré ensuite.

Avant les réactions de sulfatation et de déamination hydrolytique, préparez des solutions fraîches de 10 millimolaires de quinol et de métabisulfite de sodium saturé à pH 5,0. Étant donné que le métabisulfite de sodium est une solution saturée, de petits grumeaux peuvent demeurer non dissous. Ajoutez 208 microlitres de métabisulfite de sodium et 12 microlitres de quinol à 20 microlitres d’ADN dénaturé, pour un volume final de 240 microlitres.

Vortexez les tubes et centrifugez-les pendant 10 secondes afin de s'assurer que toutes les gouttelettes se trouvent au fond du tube. Recouvrez les échantillons d'huile minérale. Incubez les échantillons à 55 degrés Celsius dans un bain-marie pendant quatre à seize heures, selon la quantité et la qualité de l'ADN à convertir.

Il est important que la conversion au bisulfite s'effectue à l'abri de la lumière afin d'éviter l'oxydation. À la fin du temps d'incubation approprié, centrifuger brièvement les tubes dans une microcentrifugeuse afin de s'assurer que tout le liquide se trouve au fond du tube. Ensuite, prélever soigneusement la solution d'ADN à partir du fond du tube à l'aide d'une pipette, sans aspirer l'huile minérale.

Pour les prochaines étapes, notre laboratoire utilise le système de purification d'ADN Promega Wizard. Ajoutez un millilitre de résine aux échantillons d'ADN, retournez le tube pour mélanger, puis aspirez la solution à l’aide d’une pipette et transférez-la dans une seringue fixée à une colonne de désalinisation. Enfin, pour éliminer les ions bisulfite libres, faites passer l’ADN traité au bisulfite à travers la colonne de désalinisation et éluez avec 50 microlitres d’eau Milli-Q.

L'étape suivante consiste à éliminer l'attique de bisulfite de l'anneau d'uracile par désalinisation. Pour ce faire, ajoutez 5,5 µL de soude à trois molaire fraîchement préparée à chaque échantillon d'ADN traité au bisulfite, afin d'obtenir une concentration finale de 0,3 molaire. Incubez ensuite les échantillons à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes.

Centrifuger brièvement les échantillons, puis ajouter un microlitre de TRNA à chaque échantillon. Neutraliser la solution en ajoutant de l'acétate d'ammonium jusqu'à une concentration finale de trois molaire. Précipiter ensuite l'ADN à l'éthanol.

Ajouter 330 microlitres d'éthanol glacé à 100 % et mélanger soigneusement par retournement. Laisser à moins 20 degrés Celsius pendant une heure jusqu'au lendemain, puis centrifuger à 14 000 ×g pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius. Ensuite, éliminer toutes les traces de surnageant et sécher l'ADN précipité à l'air pendant environ 20 minutes.

Après séchage à l'air, le culot est presque invisible ; resuspendre le culot d'ADN dans 50 microlitres de TE 0,1 X ou d'eau, puis laisser à température ambiante pendant environ deux heures. Pendant ce temps, vortexer occasionnellement les tubes afin de garantir la dissolution de l'ADN, suivie d'une courte centrifugation. Une fois l'ADN dissous, il peut être conservé à moins 20 degrés Celsius de un à 10 ans, selon la quantité et la qualité de l'ADN, ou être utilisé immédiatement. Pour l'amplification par PCR, l'optimisation des amorces constitue l'aspect le plus difficile de cette procédure.

Par conséquent, les lignes directrices suivantes sont fournies afin de garantir la réussite de la conception des amorces. Pour illustrer ces lignes directrices, la séquence cible a été convertie par sulfite, de sorte que, lorsqu'elle est écrite, les cytosines converties apparaissent comme des Ts bleus et les sites CPG non convertis apparaissent comme des cgs rouges. Les amorces doivent avoir une longueur de 24 à 30 paires de bases afin d'assurer la spécificité. Les amorces doivent présenter une température de fusion (TM) prédite similaire supérieure à 50 degrés Celsius et ne pas différer de plus d'un à deux degrés Celsius.

Les amorces doivent contenir plusieurs bases C à T d'environ 25 % pour assurer la spécificité de la conversion. La base terminale à l'extrémité trois primes doit être un C à T afin de garantir l'amplification de l'ADN converti. Les dinucléotides CpG doivent être évités dans la séquence de l'amorce pour éviter un biais potentiel en faveur des gabarits méthylés, non méthylés ou non convertis. Toutefois, si cela est inévitable, la cytosine du site CpG doit être remplacée par un Y afin de garantir une amplification sans biais de l'ADN converti.

Enfin, concevoir des jeux d'amorces imbriquées ou partiellement imbriquées afin d'assurer la spécificité ou la sensibilité de la réaction de PCR si nécessaire. Préparer les mélanges de réaction d'amplification PCR en aliquots de 25 microlitres pour l'optimisation. Chaque réaction contient de l'ADN génomique converti au sulfite, des amorces DPS, du chlorure de magnésium, du chlorure de potassium, du tris hydrochlorure pH 8,3 et une ADN polymérase, afin de tester un biais d'amplification du matériel méthylé ou non méthylé.

Utilisez un échantillon témoin entièrement converti par bisulfite, méthylé et non méthylé à 50 %, pour tester une amplification PCR proportionnelle après conversion par bisulfite. Utilisez des amorces spécifiques et un mélange de réaction PCR dans un thermocycleur à gradient de température, en lançant la réaction selon un gradient de plus ou moins trois degrés Celsius par rapport à la température de fusion (TM) de l'amorce, réparti sur huit à dix tubes. Vortexez les tubes puis centrifugez-les brièvement dans une microcentrifugeuse avant de les placer dans le thermocycleur. Cette figure montre un gel d'agarose avec un profil d'amplification PCR en gradient de température à partir d'un mélange d'ADN méthylé et non méthylé à 50 %.

Les amplicons PCR et les bandes marquées T (bandes deux, cinq et huit) ont été traités avec une enzyme de restriction qui ne digère que l'ADN méthylé. Des conditions optimales d'amplification PCR doivent amplifier les amplicons méthylés et non méthylés proportionnellement et sans biais, produisant ainsi une quantité égale de produit PCR découpé et non découpé, comme observé ici. Les conditions optimales de thermocyclage pour une amplification sans biais sont de 55,6 degrés Celsius. La conversion complète de l'ADN au bisulfite peut être analysée par digestion avec une enzyme spécifique des sites cytosine, qui ne digère que l'ADN non converti (bandes trois, six et neuf).

La conversion complète de l'ADN par le bisulfite est indiquée ici par l'absence d'ADN coupé dans les trois voies, voies trois, six et neuf. Ce tracé de dissociation en temps réel montre une proportion égale d'ADN méthylé et non méthylé (ligne rouge orangé, mélange 50/50) par rapport à l'amplification témoin d'ADN entièrement méthylé (ligne rose, m) et d'ADN non méthylé (ligne verte, U), qui se dissocient respectivement à 82,9 degrés Celsius et à 86,9 degrés Celsius. Ceci indique qu'il n'y a pas de biais d'amplification fondé sur la température à laquelle les différentes molécules se dissocient.

Les fragments d'ADN amplifiés par PCR à partir d'échantillons traités au bisulfite peuvent être visualisés par électrophorèse sur gel d'agarose et séquencés. On observe ici directement un chromatogramme provenant de trois lignées cellulaires différentes, les sites CpG étant mis en évidence en jaune : la lignée cellulaire X présente une méthylation à 100 % aux trois sites CpG, tandis que les lignées cellulaires Y et Z montrent des degrés variables de méthylation, comme en témoignent les signaux GA superposés visibles sur la figure. La figure quatre A est un chromatogramme de trois lignées cellulaires différentes, les sites CpG étant mis en évidence en jaune.

Après le séquençage direct des clones individuels, l'état de méthylation des molécules individuelles peut être consigné dans une carte de bisulfite. Pour visualiser l'hétérogénéité de la méthylation, la densité de méthylation aux sites CpG individuels est indiquée en rouge. Dans cette carte de bisulfite représentative, l'analyse quantitative de la méthylation à haut débit d'un échantillon.

L'utilisation de la technologie Sequenom EpiTyper peut produire un spectre spécifique dépendant de la présence de cytosines méthylées, comme illustré dans l'exemple de la Figure cinq A. Un résumé des rapports dans l'échantillon peut ensuite être extrapolé sous la forme d'un épigramme, Figure cinq B. Cet exemple montre le pourcentage de méthylation de l'ADN à chaque site CpG pour quatre lignées cellulaires différentes. Enfin, un résumé sous forme de tracé de méthylation, Figure cinq C, peut être dérivé de l'épigramme après son obtention. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de l'épigénétique pour explorer la méthylation de l'ADN et son rôle dans les maladies humaines.