Injection stéréotaxique de vecteurs viraux pour la reprogrammation des cellules gliales dans un modèle murin

Fixez une souris transgénique anesthésiée dans un cadre stéréotaxique avec son crâne exposé.

Cette souris exprime la Cre recombinase dans les cellules gliales.

Positionnez le bras stéréotaxique qui maintient le tube capillaire sur le crâne et alignez-le au-dessus du bregma.

Ajustez les axes stéréotaxiques pour un ciblage précis.

Percez un trou sur le site cible, en vous assurant que la dure-mère reste intacte. Retirez les fragments d’os.

Rincer le tube capillaire avec un tampon. Aspirez une bulle d’air, puis chargez le virus adéno-associé portant des gènes de reprogrammation neuronale inactive et de protéine fluorescente.

Abaissez le tube capillaire à la profondeur cible et injectez la solution virale dans la région riche en cellules gliales.

Rétractez soigneusement le tube pour éviter le reflux.

Fermez l’incision et permettez la récupération.

Les virus internalisés délivrent des gènes inactivés flanqués de loxP au noyau glial. La cre recombinase les inverse, activant les gènes de reprogrammation neuronale et conduisant à la conversion neuronale. Les interneurones reprogrammés expriment la protéine fluorescente sous le promoteur spécifique du neurone.

Pour injecter des facteurs de reprogrammation, placez une souris anesthésiée dans le cadre stéréotaxique, administrez une analgésie appropriée au début de l’opération, puis amenez l’extrémité du capillaire en verre de l’aiguille d’injection juste au-dessus du bregma. Assurez-vous que l’embout capillaire est parfaitement droit dans les plans A-P et M-L. Réinitialisez les valeurs M-L et A-P à 0,0 sur le compteur de coordonnées numériques.

Pour vous assurer que la tête de l’animal est dans une position parfaitement plate, utilisez le compteur de coordonnées numériques pour mesurer la valeur de la coordonnée D-V lorsque le bras A-P est à plus 2,0 et moins 2,0, ainsi que lorsque le bras M-L est à plus 2,0 et moins 2,0. Ajustez la hauteur de la barre de dent et des barres d’oreille en conséquence. Ensuite, soulevez légèrement la seringue et percez un trou à l’aide d’une perceuse dentaire aux coordonnées d’injection.

Commencez à forer sur le site, en travaillant de manière circulaire et douce. Ensuite, placez un morceau de gaze de coton sur l’incision ouverte et rincez la seringue avec une solution saline. Après le rinçage, prélevez une bulle d’air, puis 1 microlitre de solution contenant le vecteur viral. Assurez-vous que la solution virale peut être facilement visualisée sous la bulle d’air.

Ensuite, abaissez la seringue en progressant lentement jusqu’à la profondeur souhaitée et assurez-vous que la trajectoire est exempte de fragments d’os. Par la suite, injectez 1 microlitre de la solution virale à raison de 0,4 microlitre par minute. Lorsque l’injection est faite, attendez deux minutes pour la diffusion avant le retrait de la seringue.

Après la diffusion, rétractez lentement la seringue jusqu’à ce que l’extrémité du capillaire soit complètement retirée du cerveau. Ensuite, suturez soigneusement l’incision et retirez l’animal du cadre stéréotaxique. Surveiller l’animal dans un poste postopératoire jusqu’à ce qu’il reprenne conscience.

Les animaux sont gardés jusqu’à 12 semaines après l’injection du virus pour permettre aux cellules gliales résidentes de se reprogrammer en neurones matures.