Injection virale stéréotaxique pour l’édition de gènes neuronaux ciblés dans le cerveau de souris

Fixez une souris anesthésiée dans un cadre stéréotaxique.

Désinfectez le cuir chevelu rasé, puis faites une incision médiane pour exposer le crâne.

Séchez le crâne et appliquez du peroxyde d’hydrogène pour améliorer la visibilité du bregma.

Localisez bregma et lambda, puis identifiez les sites cibles.

Percez soigneusement le crâne aux sites cibles.

Fixez la seringue remplie de virus à l’instrument stéréotaxique.

Le virus code pour Cas9 et un ARN à guide unique pour l’édition du génome dans les neurones du gyrus denté, ainsi qu’un rapporteur fluorescent pour marquer les neurones infectés.

Abaissez la seringue pour atteindre le gyrus denté, puis injectez lentement le virus pour assurer une distribution uniforme.

Soulevez progressivement la seringue et répétez l’injection à des coordonnées supplémentaires.

Faites une courte pause pour éviter le reflux, puis retirez l’aiguille lentement.

Répétez la procédure sur l’hémisphère opposé.

Enfin, suturez l’incision.

Le modèle est maintenant prêt pour d’autres études.

Rasez la tête d’une souris anesthésiée afin de vous préparer au site d’injection. Dirigez l’isoflurane à 4 % dans le cône nasal. Ensuite, placez la souris dans l’instrument stéréotaxique. Insérez la barre de morsure dans sa bouche jusqu’à ce que ses dents tombent dans la fente avant de fixer les barres d’oreille.

Assurez-vous que le corps de l’animal est sur le coussin chauffant et que le nez est situé dans le cône nasal. Ensuite, confirmez l’anesthésie en pinçant le pied. Ensuite, appliquez des larmes artificielles pour lubrifier les yeux. Par la suite, frottez la tête rasée avec de la povidone iodée et de la lidocaïne.

Maintenant, faites une petite incision le long de la ligne médiane du cuir chevelu. Séchez le crâne avec un écouvillon et appliquez du peroxyde d’hydrogène pour aider à visualiser le bregma. À l’aide d’une lunette de dissection, localisez le bregma sur le crâne et placez le foret au-dessus. Définissez les coordonnées stéréotaxiques numériques des plans x, y et z sur 0.

Afin de s’assurer que la tête est nivelée sur l’axe des y caudaux rostrals, placez le foret sur lambda et nivelez la tête de sorte que la coordonnée z soit à peu près égale à 0 au niveau de bregma et lambda. Pour vous assurer que la tête est nivelée le long de l’axe x, placez le foret sur le point médian entre bregma et lambda et mesurez les coordonnées z à 1 millimètre du milieu des deux côtés pour vous assurer qu’elles sont égales.

Ensuite, abaissez l’isoflurane à 2 % avant de placer la perceuse sur les coordonnées souhaitées, et percez soigneusement le crâne. Après avoir percé tous les trous, fixez la seringue remplie de virus sur l’instrument stéréotaxique. Centrez la seringue sur le trou et réglez la coordonnée z au niveau du crâne sur 0. Abaissez lentement la seringue à la profondeur z la plus profonde et commencez l’injection à un débit de 0,25 microlitre par minute à l’aide d’un injecteur stéréotaxique.

Une fois l’injection terminée à la profondeur z la plus profonde, attendez une minute avant de l’élever à la coordonnée suivante et recommencez l’injection. Continuez ce schéma jusqu’à ce que toutes les coordonnées d’injection z soient injectées. Après la dernière injection, attendez deux minutes avant de retirer la seringue. Ensuite, retirez la souris de l’instrument stéréotaxique et suturez le cuir chevelu. Appliquez de la lidocaïne et de la crème antibactérienne sur le site chirurgical et administrez des analgésiques avant de transférer l’animal dans une chambre de récupération chauffée.