Simple cartographie du destin cellulaire chez le poisson zèbre

L’objectif global de l’expérience suivante est d’effectuer une cartographie du destin et un traçage de la lignée de cellules uniques sélectionnées dans des embryons de poisson-zèbre. Ceci est réalisé en conjuguant chimiquement la fluorescéine en cage à du dextran de haut poids moléculaire. Ensuite, la fluorescéine dextran préparée en cage est micro-injectée dans des embryons de poisson-zèbre, qui est ensuite photo-activé dans des cellules sélectionnées en utilisant l’absorption de deux photons.

Après photo-activation des embryons, une analyse immunohistochimique est effectuée pour détecter la fluorescéine dextran non en cage afin de cartographier le devenir des cellules activées. En fin de compte, cette méthode peut être utilisée pour déterminer la contribution de la lignée et la localisation tissulaire des cellules uniques photoactivées. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que la microscopie à fluorescence standard, est qu’elle peut être utilisée pour marquer différentiellement des cellules uniques pour la cartographie de la foi.

Cette méthode peut nous aider à répondre à des questions clés en biologie du développement, telles que la façon dont les cellules précurseurs indifférenciées peuvent contribuer à différents types de tissus, La démonstration visuelle est essentielle car les étapes de montage de l’embryon et de photoactivation sont difficiles à apprendre sur la base de la seule description textuelle. Avant de commencer, synthétisez la fluorescéine dextran en cage et stockez-la dans des tubes recouverts de feuille métallique. Ensuite, micro-injectez des embryons au stade d’une à deux cellules avec la fluorescéine dextrane synthétisée en cage.

Une fois que les embryons ont atteint le stade de développement approprié, enrobez-les. Montez ensuite les embryons enrobés dans des aéros à faible fusion pour l’activation photo. Lorsque le surgi a solidifié charger le logiciel LSM cinq 10.

Placez un filtre jaune transparent dans le trajet du faisceau de lumière blanche, puis sélectionnez Scanner une nouvelle image et cliquez sur Démarrer le mode expert. Sélectionnez l’onglet laser, allumez le fer argon et les sources laser mi-tai. Réglez la longueur d’onde du mi tai sur sept 40 nanomètres.

Ensuite, sélectionnez l’onglet Config. Définissez les configurations de chemin optique pour l’ion argonne et le laser mitai. Sélectionnez ensuite l’onglet d’analyse.

Changez l’objectif à 20 fois 0,8. Réglez la vitesse de balayage maximale en cliquant sur la méthode de réglage maximale du mode et le nombre sur la ligne, la moyenne et un respectivement sous l’onglet canaux, désélectionnez toutes les sources laser à l’exception du mi-tai. Ensuite, placez un wattmètre dans le chemin du faisceau optique, puis sélectionnez le bouton con pour activer le balayage continu.

Ajustez le pourcentage de transmission jusqu’à ce que le wattmètre indique une puissance laser moyenne de 47 milliwatts. Arrêtez ensuite le balayage en sélectionnant le bouton d’arrêt sous l’onglet des chaînes. Désélectionnez la source laser mi tai et sélectionnez la fonte argonne.

Sélectionnez ensuite à nouveau le bouton XY rapide sous l’onglet des canaux, ajustez le sténopé. Détectez le gain, amplifiez un décalage et amplifiez à nouveau pour que le laser à fer Argonne obtienne la meilleure qualité d’image. À l’aide du contrôleur de niveau, recherchez et concentrez-vous sur la cellule à activer, puis cliquez sur le bouton d’arrêt À l’aide de l’outil de recadrage, recadrez la cellule activée de sorte que le facteur de recadrage sous l’onglet mode affiche 50 à 70.

Arrêtez ensuite le balayage en sélectionnant le bouton d’arrêt sous l’onglet Canaux. Désélectionnez le laser ion-argonne et sélectionnez le laser My Tai sous l’onglet Mode. Réglez la vitesse de balayage sur 31,46 secondes.

Sélectionnez ensuite le bouton unique pour démarrer le balayage de l’activation à deux photons de la fluorescéine dextran en cage de la cellule sélectionnée. Après l’activation, allez dans l’onglet des canaux et désélectionnez maintenant le laser mi tai et sélectionnez à nouveau le laser argon ion. Ensuite, en mode mode, réglez le facteur de zoom sur un. Prochain.

Sous l’en-tête vitesse, cliquez sur le bouton max pour définir la vitesse de balayage la plus rapide. Pour vérifier la région activée par la photo, sélectionnez rapide xy. Sélectionnez ensuite l’onglet des canaux et ajustez le sténopé et détectez à nouveau, vérifiez que la région activée par la photo n’est pas ablée au laser.

Après avoir préparé les embryons photoactivés pour la détection immunitaire de la fluorescéine dextran en cage en suivant le protocole décrit dans le manuscrit ci-joint. Lavez les embryons six fois avec du PBT et deux fois avec du tampon AP. Transférez ensuite les embryons dans des plaques à neuf puits dans le tampon AP.

Ensuite, aspirez la mémoire tampon du point d’accès et ajoutez N-B-T-B-C-I-P. Arrêtez le développement de la coloration N-B-T-B-C-I-P en aspirant la solution N-B-T-B-C-I-P. Lavez ensuite les embryons dans du PBT.

Maintenant, récupérez les embryons et secouez-les sur une plate-forme rotative pendant cinq minutes à température ambiante. Répétez ensuite le lavage PBT deux fois de plus. Enfin, montez les embryons dans des aros à faible point de fusion de 0,6 % et acquérez des images des cellules photoactivées à l’aide d’un microscope composé vertical.

Sur cette figure, une image en fond clair montrée à gauche et une image fluorescente montrée à droite d’un embryon de poisson-zèbre micro-injecté à brin de fluorescéine en cage avant l’activation de la photo. Comme le montre ici, l’embryon a été photo-activé dans l’un des somites indiqués par la flèche dans la figure en fond clair à gauche avec une longueur d’onde de sept 40 nanomètres, un temps de balayage de 31 secondes et une puissance laser moyenne de 47 milliwatts. Dans la figure de droite, la fluorescence de la fluorescéine dextran non cageuse peut être observée sur cette figure.

La coloration immunitaire de la fluorescéine dextran non en cage est représentée dans une petite région de la plaque latérale, mésoderme d’un 10. Ainsi, l’embryon au stade de l’acarien a été photo-activé en utilisant les mêmes paramètres laser que dans la figure précédente en utilisant la procédure d’immunodétection. La région activée, comme indiqué ici par la flèche, peut être identifiée avec une coloration de fond minimale Suite à cette procédure.

Des analyses supplémentaires telles que l’immunocoloration pour différents marqueurs tissulaires spécifiques peuvent être effectuées afin de mieux caractériser l’emplacement et le devenir des cellules marquées. Grâce à cette technique, les chercheurs dans le domaine de la biologie vasculaire étudient l’origine de l’artère dans les cellules progénitrices veineuses chez les embryons de poisson-zèbre en développement. N’oubliez pas que lorsque vous travaillez avec des réactifs chimiques tels que le NBT et le BCIP, ils peuvent être extrêmement dangereux et que des gants doivent toujours être portés.