Simple cartographie du destin cellulaire chez le poisson zèbre

L'objectif général de l'expérience suivante est de réaliser une cartographie du destin cellulaire et un traçage de lignage de cellules uniques sélectionnées chez des embryons de poisson zèbre. Cette approche est mise en œuvre en conjuguant chimiquement de la fluorescéine piégée à du dextran de haut poids moléculaire. Ensuite, le dextran marqué à la fluorescéine piégée ainsi préparé est micro-injecté dans des embryons de poisson zèbre, puis activé par lumière dans des cellules sélectionnées à l'aide d'une absorption à deux photons.

Après l'activation photochimique des embryons, une analyse immunohistochimique est réalisée afin de détecter le dextran marqué par la fluorescéine démasquée, permettant ainsi de cartographier le destin des cellules activées. En définitive, cette méthode peut être utilisée pour déterminer la contribution lignagère et la localisation tissulaire des cellules uniques activées par la lumière. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que la microscopie de fluorescence classique, réside dans sa capacité à marquer de façon différentielle des cellules uniques pour la cartographie fidèle de leur lignage.

Cette méthode peut nous aider à répondre à des questions clés en biologie du développement, comme la manière dont les cellules souches non différenciées peuvent contribuer à différents types de tissus. Une démonstration visuelle est essentielle, car les étapes de montage de l'embryon et d'activation photo sont difficiles à apprendre uniquement à partir d'une description textuelle. Avant de commencer, synthétisez du dextran de fluorescéine piégée et conservez-le dans des tubes recouverts de feuille métallique. Ensuite, injectez par microinjection les embryons au stade une à deux cellules avec le dextran de fluorescéine piégée synthétisé.

Une fois que les embryons ont atteint le stade de développement approprié, les recouvrir. Ensuite, monter les embryons recouverts dans de l'agarose à bas point de fusion pour l'activation photo. Une fois que l'agarose est solidifiée, charger le logiciel LSM five 10.

Placez un filtre jaune transparent sur le trajet du faisceau de lumière blanche, puis sélectionnez l'option de numérisation d'une nouvelle image et cliquez sur démarrer le mode expert. Sélectionnez l'onglet laser, activez les sources laser au gaz argon et au laser Mi Tai. Réglez la longueur d'onde du laser Mi Tai à sept cent quarante nanomètres.

Ensuite, sélectionnez l'onglet config. Réglez les configurations du trajet optique pour l'ion argon et le laser Mi Tai. Puis, sélectionnez l'onglet scan.

Changer l'objectif pour un grossissement de 20 fois 0,8. Régler la vitesse maximale de balayage en cliquant sur la méthode max set et en indiquant respectivement « line mean » et « one » sous l'onglet canaux, puis désélectionner toutes les sources laser sauf le Mi Tai. Ensuite, placer un mesureur de puissance dans le trajet optique du faisceau, puis sélectionner le bouton « con » pour activer le balayage continu.

Réglez le pourcentage de transmission jusqu'à ce que le puissancemètre affiche une puissance laser moyenne de 47 milliwatts. Arrêtez ensuite le balayage en cliquant sur le bouton d'arrêt sous l'onglet canaux. Désélectionnez la source laser mi tai et sélectionnez l'argon fer.

Ensuite, sélectionnez à nouveau le bouton XY rapide sous l'onglet canaux, puis réglez le diaphragme. Réglez le gain de détection, amplifiez un décalage, puis amplifiez à nouveau pour le laser au fer d'Argonne afin d'obtenir la meilleure qualité d'image. À l'aide du contrôleur de la platine, localisez et mettez au point la cellule à activer, puis cliquez sur le bouton d'arrêt. À l'aide de l'outil de recadrage, recadrez la cellule activée de sorte que le facteur de recadrage sous l'onglet mode affiche entre 50 et 70.

Ensuite, arrêtez l'analyse en sélectionnant le bouton d'arrêt sous l'onglet canaux. Désélectionnez le laser à ions argon et sélectionnez le laser My Tai sous l'onglet mode. Réglez la vitesse de balayage à 31,46 secondes.

Ensuite, sélectionnez le bouton unique pour démarrer la numérisation destinée à l'activation biphotonique de la dextrane fluorescéine piégée de la cellule sélectionnée. Après l'activation, accédez à l'onglet canaux, puis désélectionnez le laser mi tai et réactivez le laser à ions argon. Ensuite, dans le menu mode, réglez le facteur de zoom à un. Suivant.

Sous l'en-tête Vitesse, cliquez sur le bouton max pour définir la vitesse de balayage la plus élevée. Pour examiner la région activée par la lumière, sélectionnez xy rapide. Ensuite, sélectionnez l'onglet Canaux et réglez le diaphragme, puis détectez à nouveau ; vérifiez que la région activée par la lumière n'est pas ablatée par le laser.

Après avoir préparé les embryons photoactivés pour la détection immunologique du dextran fluorescéine démasqué en suivant le protocole décrit dans le manuscrit associé, lavez les embryons six fois dans du PBT et deux fois dans du tampon AP. Transférez ensuite les embryons dans des plaques à neuf puits contenant du tampon AP.

Ensuite, aspirez la solution AP et ajoutez le N-B-T-B-C-I-P. Arrêtez le développement de la coloration par le N-B-T-B-C-I-P en aspirant la solution de N-B-T-B-C-I-P. Puis lavez les embryons dans du PBT.

Récupérez maintenant les embryons et agitez-les sur une plateforme rotative pendant cinq minutes à température ambiante. Répétez ensuite le lavage au PBT deux fois supplémentaires. Enfin, montez les embryons dans de l'agarose à bas point de fusion à 0,6 % et acquérez des images des cellules photoactivées à l’aide d’un microscope composé droit.

Dans cette figure, une image en champ clair présentée à gauche et une image en fluorescence présentée à droite montrent un embryon de poisson zèbre micro-injecté avec une chaîne de dextrane de fluorescéine piégée avant l'activation photochimique. Comme indiqué ici, l'embryon a été activé par lumière dans l'un des somites, indiqué par la flèche sur l'image en champ clair à gauche, à l'aide d'une longueur d'onde de 407 nanomètres, d'un temps de balayage de 31 secondes et d'une puissance laser moyenne de 47 milliwatts. Sur l'image de droite, après l'activation photochimique, une fluorescence provenant du dextran de fluorescéine dépiégé peut être observée.

La coloration immunitaire du dextran fluorescéine démasqué est illustrée dans une petite région de la plaque latérale, le mésoderme d'un embryon au stade 10 heures post-fécondation, qui a été photoactivé en utilisant les mêmes paramètres laser que dans la figure précédente, selon la procédure de détection immunologique. La région activée, indiquée ici par la flèche, peut être identifiée avec un fond de coloration minimal après cette procédure.

Des analyses supplèmentaires, telles que la coloration immunohistochimique pour différents marqueurs spécifiques aux tissus, peuvent être réalisées afin de mieux caractériser la localisation et le destin des cellules marquées. Grâce à cette technique, la voie est ouverte aux chercheurs dans le domaine de la biologie vasculaire pour étudier l'origine des cellules progénitrices artérielles et veineuses au cours du développement des embryons de poisson zèbre. N'oubliez pas que lors de l'utilisation de réactifs chimiques tels que le NBT et le BCIP, ceux-ci peuvent être extrêmement dangereux et que des gants doivent toujours être portés.