Modélisation des cellules souches embryonnaires utilisant la puce Bio Retourner
1 octobre 2007
Nous démontrons une méthode simple pour placer les cellules à des endroits désirés sur un substrat. Cette méthode schémas cellules en retournant une puce de silicone contenant des micropuits remplis de cellules sur le substrat. Cette méthode offre une nouvelle façon de moduler la signalisation diffusibles et juxtacrine entre les cellules.
Je suis Nickel Mital. Je suis étudiant diplômé dans le laboratoire de Bowman. Aujourd'hui, je vais parler d'un dispositif mis au point par deux anciens étudiants de notre laboratoire, appelé la puce bio-inversée.
Cet appareil permet la délivrance de cellules sur un substrat choisi par l'expérimentateur, selon une configuration également choisie par l'expérimentateur. L'appareil lui-même, dont nous avons un exemplaire ici, est très simple. Il se compose essentiellement de petits puits dans un morceau de silicone.
Chaque puits est généralement conçu pour contenir uniquement une cellule, mais si nécessaire, nous pouvons bien sûr les rendre plus grands. La fabrication du dispositif est réalisée de sorte que les puits soient disposés de la même manière que les cellules se retrouveront finalement sur le substrat. Ainsi, le dispositif lui-même est fabriqué à l’aide de lithographie par photopolymérisation douce.
En particulier, nous utilisons du PDMS, qui est du polydiméthylsiloxane, et nous en faisons un moule à partir d'une tranche de silicium. Nous en avons un ici. Le porte-moule lui-même est fabriqué par photolithographie standard afin de structurer une résine photosensible SUA, qui est déposée par centrifugation sur la tranche de silicium.
Donc, en résumé, les cellules sont transférées sur le substrat choisi en remplissant simplement les puits de la puce bio-inversée avec ces cellules. Nous appliquons ensuite la puce sur le substrat désiré, souvent une culture tissulaire en polystyrène. Enfin, nous retournons l'ensemble, permettant aux cellules de sortir des puits et de tomber sur le substrat.
Je suis Stephanie Flavin. Je suis étudiante chercheuse au laboratoire Goldman, et aujourd'hui je vais vous montrer comment utiliser la puce bio flip pour imprimer des cellules la veille d'une expérience de marquage.
Nous allons lier le PDMS à un porte-lame en verre de un pouce sur un pouce par soudage au plasma. Ensuite, nous immergeons la puce toute la nuit, côté puits vers le bas, dans une solution de PBS. Nous découpons également des joints qui seront utilisés lors de l'expérience de dessin et prélevons des pinces à linge qui serviront également.
Appliquez 200 microlitres de BSA sur la surface de chaque puce. Agitez délicatement la surface de la puce avec la pointe de la pipette pour éliminer les bulles et permettre à la solution de BSA de remplir les puits. Laissez les puces reposer sous la hotte pendant une heure sous exposition à la lumière UV, comme d'habitude.
Après une heure, aspirez la solution de BSA des puces et rincez chaque puce avec 200 microlitres de PBS. Appliquez ensuite 200 microlitres de solution de cellules de passage à une densité de 10⁶ cellules par millilitre. Après avoir attendu cinq à dix minutes que les cellules tombent dans les puits, rincez la surface de la puce avec du PBS. Inclinez la puce vers un coin à un angle d’environ 15 degrés et pipetez lentement la solution cellulaire à partir du coin inférieur de la puce.
Replacer la puce à niveau et ajouter lentement 50 microlitres de PBS dans l'angle supérieur. Répéter l'étape de lavage autant de fois que nécessaire. Une fois que les XLS ont été éliminés de la surface de la puce, ajouter environ 50 microlitres de milieu dans le joint interne de la boîte.
Ajouter du milieu au-dessus de chaque puce. Ensuite, retourner la boîte et l'incliner en la posant sur la surface de la puce, en commençant par un coin. Puis aplatir la boîte sur la puce de manière à éviter la formation de bulles entre la boîte et la puce.
Ajouter des pinces à linge de chaque côté de la puce pour la maintenir en place. Retirer les poignées de chaque pince à linge afin que, lorsque la puce est retournée, elle repose à plat sur la boîte. Déplacer la puce vers l’incubateur et la retourner rapidement, en évitant tout déplacement inutile.
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Aperçu
Cette étude présente une méthode innovante permettant de positionner des cellules sur un substrat à l'aide d'un dispositif appelé bio puces inversées. En retournant une puce en silicone comportant des micropuits remplis de cellules sur le substrat, les chercheurs peuvent contrôler efficacement le positionnement cellulaire, améliorant ainsi la modulation des signaux entre les cellules.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Biologie cellulaire
- Neurosciences
- Bioingénierie
Contexte
- Le positionnement des cellules est essentiel pour l'étude des interactions cellulaires.
- Les méthodes actuelles peuvent manquer de précision dans le placement des cellules.
- La puce bio-inversée offre une solution simple et efficace.
- Cette technique peut influencer à la fois la signalisation diffusible et la signalisation juxtacrine.
Objectif de l'étude
- Développer une méthode fiable pour le positionnement des cellules sur des substrats.
- Approfondir la compréhension des mécanismes de signalisation cellulaire.
- Fournir un outil aux chercheurs dans divers domaines biologiques.
Méthodes utilisées
- Conception et fabrication de la puce bio inversée.
- Remplissage des micropuits avec des cellules.
- Retournement de la puce sur le substrat souhaité.
- Observation et analyse du positionnement cellulaire et de la signalisation.
Résultats principaux
- Placement réussie des cellules à des emplacements ciblés.
- Amélioration de la modulation de la signalisation cellulaire.
- Démonstration de la facilité d'utilisation du dispositif.
- Applications potentielles dans divers dispositifs expérimentaux.
Conclusions
- La puce bio inversée est un outil innovant pour le positionnement des cellules.
- Cette méthode peut avoir un impact significatif sur les études concernant la signalisation cellulaire.
- De futures recherches pourront s'appuyer sur cette technique afin de l'étendre à des applications plus larges.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
Le contrôle spatial précis des populations cellulaires permet une interrogation mécanistique des voies de signalisation diffusibles et juxtacrines, essentielles pour la validation de cibles dans les modèles de maladies à base de cellules souches. La puce Bio Flip Chip offre une méthode indépendante du substrat et préservant la chimie pour structurer des microenvironnements cellulaires définis, facilitant le développement reproductible de tests destinés au criblage phénotypique. Cette approche renforce la fiabilité prédictive en phase précoce de découverte en réduisant la variabilité du contact cellule-cellule et de l'exposition aux facteurs paracrines, améliorant ainsi la continuité translationnelle entre les modèles in vitro et la validation préclinique.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet de tester des hypothèses sur la manière dont la densité cellulaire localisée et l'agencement spatial influencent les voies de différenciation et d'auto-renouvellement des cellules souches.
- Valeur opérationnelle : Élimine la variabilité stochastique liée au semis aléatoire, garantissant des signaux juxtacrines et paracrines constants entre les réplicats.
- Valeur prédictive : Facilite la réduction des risques mécanistiques en isolant la contribution des signaux dépendants du contact par rapport aux signaux solubles dans les études d'engagement ciblé.
Tests et développement de dosages
- Valeur scientifique : Génère des réseaux cellulaires quantifiables et spatialement définis, compatibles avec l'imagerie à haut contenu et des lectures multiplexées.
- Valeur opérationnelle : Permet la standardisation des tests d'interaction cellule-cellule sur des surfaces en polystyrène pour culture tissulaire, en verre, en Matrigel ou sur des couches de cellules nourricières, sans modifier la chimie du substrat.
- Extensibilité : Compatible avec l'impression par microcontact pour créer des motifs de matrice extracellulaire, offrant un contrôle combinatoire des signaux d'adhésion et de signalisation.
Recherche translationnelle et préclinique
- Continuité translationnelle : Ordonne les cellules souches embryonnaires dans des niches définies afin de modéliser les voies de signalisation du développement pertinentes pour les troubles congénitaux et la médecine régénérative.
- Modélisation préclinique : Permet l'analyse de la relation dose-réponse des morphogènes ou des thérapeutiques dans des microenvironnements spatialement contrôlés, améliorant ainsi la pertinence physiologique.
- Progression ajustée au risque : Réduit les faux positifs lors de l'identification des candidats prometteurs en minimisant le bruit dû à l'agrégation non contrôlée des cellules ou à la fréquence variable des contacts.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La puce Bio Flip s'intègre aux flux de travail de la phase de découverte précoce en permettant un marquage reproductible des cellules souches avant l'exposition aux composés, soutenant ainsi le criblage orienté par des hypothèses et les études mécanistiques complémentaires lors de l'optimisation des candidats médicaments.
- Biologie de la découverte : Évalue comment l'organisation spatiale définie des cellules souches embryonnaires module la spécification des lignées et l'activité des voies de signalisation.
- Essais de criblage : Fournit des substrats cellulaires standardisés et reproductibles pour évaluer les effets de composés sur les signaux dépendants des contacts et les signaux diffusibles.
- Analytique : Permet une cartographie spatiale quantitative de l'expression des marqueurs, de la prolifération et de l'apoptose en tant que variables dépendantes dans des co-cultures structurées.
- Recherche translationnelle : Modélise les cascades de signalisation du développement humain dans des systèmes à organisation spatiale contrôlée afin d'orienter le choix des cibles en phase préclinique.
- Réutilisation en entreprise : Fonctionne comme une plateforme modulaire de structuration adaptable à plusieurs types cellulaires, substrats et configurations de matrice extracellulaire à travers différents projets.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance dans la validation des cibles en réduisant le bruit biologique provenant des interactions cellule-cellule non contrôlées.
- Valeur opérationnelle : Garantit la reproductibilité des tests grâce à un positionnement précis des cellules défini par l’utilisateur, indépendamment des variations liées aux méthodes de semis.
- Valeur stratégique : Améliore l’efficacité des décisions de poursuite ou d’abandon en augmentant le rapport signal/bruit dans les criblages phénotypiques ciblant la communication intercellulaire.
- Impact sur le portefeuille : Favorise la priorisation ajustée au risque des modulateurs des voies juxtacrines (par exemple, Notch, Wnt) dans les domaines thérapeutiques liés aux cellules souches.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en lithographie douce et en manipulation de PDMS pour la fabrication ou l'acquisition de puces.
- Suppose un accès à un équipement de liaison au plasma et à un traitement UV/ozone pour la préparation du substrat.
- Exige des protocoles standardisés de préparation et de lavage des cellules afin d'assurer un chargement et un relâchement efficaces dans les puits.
- L'adaptation à des matrices 3D ou à des systèmes microfluidiques peut nécessiter une optimisation du moment du retournement et de l'énergie de surface.
- Limite pratique : l'occupation des puits doit être déterminée empiriquement pour chaque type et taille de cellule afin d'éviter le chargement de plusieurs cellules dans des puits conçus pour une seule cellule.
