Name: Coupez-chargement: Un outil utile pour examiner létendue du couplage Tracer Gap jonction entre neurones rétiniens (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 11 s
Description: Découvrez la méthode de cut loading pour évaluer le couplage par jonctions communicantes entre neurones rétiniens intactes. Cette technique utilise le neurobiotine comme traceur pour quantifier la diffusion intercellulaire sous différentes conditions d'éclairage.

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Ce travail a été financé par le NIH aux subventions EY005102 SCM et EY018640 à CPR

1. Intact préparation rétine neurale pour les poissons rouges, les souris et les lapins <ol><li> Effectuez toutes les étapes suivantes, y compris ceux décrits dans "2) Coupez-loading», sous ambiante constante (au fond) d'illumination. S'il vous plaît noter que pour les fins du présent protocole, les procédures sont décrites comme étant effectuées dans l'obscurité constante (c'est à dire sous très sombre (c'est à dire «scotopique») des conditions ≤ 0,0001 lux) en utilisant des lunettes de vision nocturne à infrarouge, mais d'autres niveaux d'intensité plus élevée de l'illumination ambiante constante peut être utilisé au lieu de déterminer l'effet des autres niveaux d'éclairage ambiant sur la jonction lacunaire traceur accouplement. </li><li> Dark-adaptation de l'animal expérimental (poissons rouges, souris ou de lapin) pendant au moins 1 heure avant la chirurgie. </li><li> Comme décrit précédemment 7, profondément anesthésier les poissons rouges en les plaçant dans tricaïne méthanesulfonate (MS222, 150 mg / L d'eau du réservoir de poissons tamponnée (bicarbonate de sodium contenant)), et profondément anesthésier les souris avec de la kétamine (100 mg/ Kg, ip) et Rompun (10 mg / kg, ip). Profondément anesthésier le lapin à l'uréthane (dose de charge: 2,0 g / kg, ip) et aussi utiliser une anesthésie locale intraorbitaire (2% Xylocaine), comme décrit précédemment 8. Toutes les procédures expérimentales impliquant le soin et l'utilisation d'animaux doit être effectué conformément aux directives fédérales et d'être examinées et approuvées par les soins des animaux de l'université locale et les comités de l'utiliser. (Remarque:. Dans les expériences décrites ici, toutes les procédures d'expérimentation impliquant le soin et l'utilisation des poissons, des souris et des lapins ont été effectuées en conformité avec les directives du NIH et ont été examinés et approuvés par l'Ohio State University en soins des animaux et du Comité institutionnel Utilisations) </li><li> Pour les poissons, les souris et les lapins, après énucléation, retirez la partie antérieure de chaque globe oculaire. Ensuite, placez un morceau de papier filtre sur le dessus de la partie postérieure de l'œil et inverser le papier filtre et les yeux, de sorte que le papier-filtre se trouve sous la partie postérieure de l'œil. Puis, en utilisant bienpince disséquer la rétine intacte neurones de la partie postérieure de l'œil par un léger arrachement de l'épithélium pigmentaire / choroïde / sclérotique, qui sont attachés les uns aux autres, de la rétine neurale, qui est fixé sur le papier filtre. Comme cela est fait, couper le nerf optique à l'aide fines ressort des ciseaux. La rétine neurale, orientée photorécepteur vers le haut, doit maintenant être fixé sur le papier filtre et séparé du reste de l'œil. </li></ol> 2. Coupez-chargement <ol><li> Immerger les rétines dans une solution oxygénée Ringer (tableau 1) dans une plaque à 6 puits (~ 5 ml / puits) pendant 30 min sous ambiante constante (au fond) d'éclairage (par exemple sous très sombre (c'est à dire «scotopique») conditions) avec ou sans un médicament d'essai. Maintenir rétines de poissons dans oxygénée (5% de CO 2 / 95% O 2) à base de bicarbonate de Ringer à 22 ° C en scellant la plaque de 6 puits avec du parafilm et de maintenir la rétine de souris et le lapin à 36 ° C dans un 5% de CO 2 / 95% d'O <li> Préparer la solution de traceur (typiquement 100 uL) en dissolvant neurobiotin (0,5%), une molécule biotinylée, dans la solution de Ringer immédiatement avant la coupe à travers la rétine. Notez que 0,5% de rhodamine dextrane (élevé (&gt; 10 000) MW) peut être ajouté à la solution. Grâce à son poids moléculaire élevé, la rhodamine dextran ne traverse pas les jonctions et seulement les cellules des étiquettes qui ont été endommagés par la coupe. Comme indiqué dans la Fig. 3, c'est un moyen utile pour distinguer les cellules qui ont accumulé neurobiotin parce qu'ils ont été blessés, de ceux qui ont accumulé le traceur par diffusion à travers les jonctions communicantes. </li><li> Placer la solution neurobiotin sur un verre (ou plastique) boîte de Pétri, appuyez sur le papier filtre, à laquelle la rétine est attaché, sur un papier absorbant pour enlever l'excès de Ringer, tremper une lame de rasoir (ou autre lame tranchante) dans la solution et neurobiotin l'n faire une coupe radiale à travers la rétine et du papier filtre. Si l'on préfère, les entretoises peuvent être utilisés de telle sorte que la coupe est faite à travers la rétine, mais pas le papier filtre. La coupe doit être orientée perpendiculairement à la surface de la rétine. Trempez la lame de rasoir dans la solution neurobiotin nouveau et couper la rétine une seconde fois. Répétez cette jusqu'à 4 coupes par la rétine (voir fig. 1). Utiliser un microscope à dissection lors des coupes de rasoir grâce à la souris et autres petits rétines. </li><li> Comme indiqué dans la Fig. 1, submerger la rétine à nouveau dans le milieu de Ringer frais, avec ou sans médicament d'essai, en utilisant une plaque de 6 puits (5 ml Ringer / puits). Incuber la rétine pendant 15 min pour permettre le chargement et la diffusion. </li><li> Laver trois fois pendant 5 min chacun avec un milieu de Ringer frais avec ou sans médicament testé. </li><li> Fixer la rétine avec du paraformaldéhyde 4% dans un tampon phosphate à 0,1 M (PBS, pH 7,4) pendant 1 heure à température ambiante. </li><li> Laver avec 0,1 M PBS pendant une nuit à 4 ° C. </li><li> Le jour suivant, réagissent wvec 2% streptavidine-Alexa 488 (concentration finale 10 pg / ml) dans 0,1 M PBS + 0,3% de Triton X-100, et de garder une nuit à 4 ° C. </li><li> Laver trois fois chacune pendant 10 minutes avec 0,1 M de PBS à température ambiante </li><li> En PBS, détacher la rétine du papier filtre et ensuite, en utilisant un pinceau fin, placer la rétine, orientée photorécepteur vers le haut, sur une lame. </li><li> Doucement monter avec Vectashield milieu de montage (Vector Laboratories, Burlingame, CA). </li><li> Prenez des photos avec un microscope confocal à balayage laser (par exemple Zeiss 510 META) à l'agrandissement, la même résolution et les paramètres pour chaque condition expérimentale, afin que vous puissiez comparer les effets de différentes conditions expérimentales (par exemple test de médicaments, les conditions d'éclairage) sur l'étendue des l'écart de jonction traceur d'accouplement (Fig. 2A-C et fig. 4A-C). Bien que d'une seule image peut contenir toutes les cellules marquées, il est recommandé que vous collectez un z-stack de la zone d'intérêt et de s'effondrer en un seull'image. </li></li></ol> 3. Quantification des traceurs de couplage utilisant ImageJ <ol><li> Dans le navigateur d'image LSM, ouvrez l'image, cliquez sur Exporter et enregistrez l'image comme un peu TIF-16 PAS fichier compressé. La barre d'échelle devraient être inclus dans cette image TIF. </li><li> Utiliser NIH ImageJ logiciels, de mesurer l'intensité de fluorescence d'Alexa-488-étiquetés neurobiotin à faible grossissement des images de toute monture rétines. Ouvrez le fichier TIF en utilisant le logiciel ImageJ puis tracer une ligne droite correspondant à la barre d'échelle. Aller à la ANALYSER, SET SCALE et entrez la distance connue et l'unité de longueur, puis cliquez sur OK. Maintenant les résultats de mesure peuvent être présentés dans des unités étalonnées, comme millimètres. </li><li> Sélectionnez la zone d'intérêt en utilisant l'outil de sélection rectangulaire. Le pic de fluorescence doit être placé à la bordure gauche de votre sélection. Assurez-vous qu'il n'ya pas de signal de fluorescence près de la frontière droite. Si non, faire pivoter l'image active (IMAGE, puis tourner). </li><li> CliquezAnalyser et diagramme des profils. Vous devriez voir une courbe avec une décroissance exponentielle de la gauche vers la droite. </li><li> Cliquez sur Copier dans la fenêtre pop-up et le coller dans EXCEL. Maintenant, vous voyez deux colonnes indiquant la distance de la coupe (colonne de gauche) et l'intensité de fluorescence en fonction de la distance de la coupe (colonne de droite). </li><li> Diviser chaque valeur brute de fluorescence par la valeur maximale de fluorescence pour obtenir l'intensité relative de fluorescence. </li><li> Copiez deux colonnes correspondant à la distance de la coupe (X) et l'intensité de fluorescence relative (Y), puis les coller dans le logiciel Origin. </li><li> Fit avec la décroissance exponentielle # 1 fonction (fig. 2D et figure 4D.), Qui est de la forme: Y = Y 0 + Y max * exp (-x / λ) où Y est l'intensité relative de fluorescence, Y o est la fluorescence de fond, Y max est la fluorescence maximale relative, λ est le spACE (longueur) et constante, et x est la distance de la coupe. </li><li> Comparez la constante d'espace (λ) des valeurs à différentes conditions expérimentales en utilisant le test t ou analyse de variance (fig. 2E et Fig. 4E). Notez que les techniques alternatives de quantification ont été décrits par d'autres 13,14. </li></ol> 4. Les résultats représentatifs Des exemples représentatifs de traceur de cellules photoréceptrices de couplage tel que déterminé par la coupe de chargement sont présentés dans les figures 2 et 3 (poissons) et la figure 4 (le lapin). Images confocale ont été prises avec les mêmes réglages pour la comparaison (Fig. 2A-C et fig. 4A-C) et l'intensité de fluorescence a été tracée en fonction de la distance entre le coupé et monté par la fonction exponentielle montré au n ° 3.8 ci-dessus (Fig. 2D et Fig. 4D). Des valeurs constantes de l'espace pour chaque conditionsont présentés aux figures 2E et 4E, ce qui montre que l'ampleur de la jonction lacunaire traceur couplage peut être quantifiée en utilisant la technique du cut-chargement. En outre, les résultats sont hautement reproductibles. L'utilisation de la technique du cut-chargement comme un moyen de quantifier l'ampleur de la jonction lacunaire traceur couplage est également validé par la constatation que l'intensité de fluorescence décroît exponentiellement en fonction de la distance de la coupe dans tous les cas examinés 7,8 (voir aussi fig. 2D et 4D ici), ce qui indique que les photorécepteurs neurobiotin entrés via la coupe au rasoir et non à partir d'autres sites de la rétine. Par ailleurs, l'qualitativement similaire jour / nuit de différence dans le couplage des photorécepteurs traceur cellulaire observée chez les poissons rouges avec des injections traçantes en cônes unique et avec une coupe de chargement 7 corrobore coupe de chargement comme un moyen relativement précise de mesurer l'étendue du couplage des photorécepteurs. La coupe-Ltechnique de oading peuvent également être utilisées pour étudier d'autres types de synapses électriques dans la rétine. Par exemple, la figure 5 montre que le lapin de type A (figure 5A) et de type B (Fig. 5B), les cellules horizontales présentent homologues traceur couplage suivante coupe le chargement et la diffusion de neurobiotin adaptés à l'obscurité sous conditions. <table border="1"><tbody><tr><td> Composé </td><td> Poissons </td><td> Souris </td><td> Lapin </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 130 </td><td> 120 </td><td> 117 </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> 20 </td><td> 25 </td><td> 30 </td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4 </td><td> - </td><td> 1 </td><td> 0.5 </td></tr><tr><td> KCL </td><td> 2.5 </td><td> 5 </td><td> 3.1 </td></tr><tr><td> Le glucose </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 1 </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> MgSO 4 7H 2 O- </td><td> - </td><td> 1 </td><td> 1.2 </td></tr><tr><td> La glutamine </td><td> - </td><td> 0.1 </td><td> 0.1 </td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> 0.7 </td><td> 2 </td><td> 2 </td></tr></tbody></table> Tableau 1: Composition des solutions de la Ringer pour les poissons rouges, la souris et le lapin rétines. Les concentrations sont présentés en mM. Les solutions de Ringer sont buller avec 5% de CO 2 / 95% O 2 et maintenue à 22 ° C (poissons) ou 36 ° C (mammifères). "-": Pas inclus dans le Ringer pour cette espèce. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3180/3180fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figure 1"> Figure 1:. Organigramme montrant la procédure limite de chargement. Après isolement of la rétine neurale intactes, plusieurs coupures radiales ont été faites par une lame qui a été trempé dans une solution neurobiotin 0,5%. La rétine a été incubé pendant le chargement traceurs et de diffusion, puis lavés avant la fixation au paraformaldéhyde 4% (PFA) en tampon phosphate 0,1 M (PB). Tracer couplage a été examiné en utilisant la streptavidine conjuguée à Alexa-488. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3180/3180fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Jour-nuit différence de photorécepteur traceur couplage dans le poisson rouge est révélée par la technique du cut-chargement. Photorécepteur écart de jonction neurobiotin traceur couplage a été étendue à la nuit (B) et dans les jours suivant l'application de spipérone (10 M), un antagoniste sélectif de dopamine D receptor 2 (C), mais pas dans la journée dans des conditions de contrôle (A). D) normalisé intensité relative fluorescentes en fonction de la distance entre les coupes (indiquées par des flèches en AC). Val espace E) constantUES obtenue à partir des données des expériences D et d'autres (n = 4). *** P &lt;0,001. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3180/3180fig3.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figure 3"> Figure 3. Un exemple représentatif montrant la fluorescence dans la couche de cellules photoréceptrices de la rétine, adaptés à l'obscurité, la nuit suivante goldfish coupé de chargement avec une solution de deux neurobiotin et la rhodamine dextrane. Rhodamine dextrane (en rouge), qui ne diffuse pas à travers l'ouverture de canaux de jonction écart en raison de son poids moléculaire élevé (&gt; 10 000 MW), seules les cellules étiquetées près de la coupe. En revanche, neurobiotin (représenté en vert) diffusé à travers les jonctions communicantes et peuvent être vus dans les cellules photoréceptrices loin de la coupe. L'emplacement de la coupe est indiquée par la flèche dans chaque panneau. Barre d'échelle: 200 um. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/3180/3180fig4.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figure 4"> Figure 4. Jour-nuit diffèrentrence dans les photorécepteurs de la rétine de couplage traceur lapin est révélée par la technique du cut-chargement. Photorécepteur écart de jonction neurobiotin traceur couplage a été étendue à la nuit (B) et dans les jours suivant l'application de spipérone (10 uM) (C), mais pas dans la journée dans des conditions de contrôle (A). En courant alternatif, les vues perpendiculaires de la reconstruction 3D des photorécepteurs de lapin près de la coupe sont représentés. D) normalisé intensité relative fluorescentes en fonction de la distance entre les coupes. E) Les valeurs de l'espace constante obtenue à partir des données dans des expériences de développement et d'autres (n = 3). *** P &lt;0,001. <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/3180/3180fig5.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figure 5"> Figure 5. Couper le chargement révèle que adaptés à l'obscurité des cellules de lapin sont horizontaux traceurs couplés. Les deux de type A (A) et de type B (B) des cellules horizontales adaptés à l'obscurité rétines de lapin exposées homologues neurobiotin traceur accouplement.

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<li>Mills, S. L., Massey, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+biotinylated+tracers+distinguishes+three+types+of+gap+junction+in+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A series of biotinylated tracers distinguishes three types of gap junction in retina.</a> J. Neurosci. 20, 8629-8636 (2000).</li>
</ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

La méthode de coupe de chargement décrite ici est une technique utile et simple pour déterminer l&#39;étendue de couplage traceur fossé jonction entre les neurones rétiniens dans des conditions d&#39;illumination différentes et à différents moments de la journée et la nuit. Avantages de cette technique incluent la possibilité de quantifier l&#39;ampleur du couplage traceur écart de jonction entre les neurones dans le tissu rétinien intactes sous une variété de conditions d&#39;éclairage pendant le jour et la nuit et de le faire pour les neurones qui ont couplé soma petit diamètre. Limites de la technique dans l&#39;étude des jonctions gap à l&#39;automne des tissus intacts dans deux catégories générales. Premièrement, la diffusion traceur à travers les jonctions ouvertes peuvent être relativement difficiles à observer à cause de a) le faible diamètre de la charge ou associés à des canaux ouverts et b) les volumes relatifs des compartiments cellulaires couplées 1,14,15. Autrement dit, la diffusion du traceur dans une petite cellule à une plus grande cellule ou un groupe de cellules couplées, compARED à la diffusion de traceurs d&#39;une cellule plus grande à une petite cellule, peut-être plus difficile à détecter en raison de la dilution du traceur. Deuxièmement, dans certaines conditions physiologiques, l&#39;étendue de la diffusion de traceur à travers des jonctions communicantes dans les tissus intacts peut ne pas refléter avec précision la force de la conductance jonctions lacunaires en raison de différences dans la conductance des petits porteurs de courant électrique d&#39;ions, par rapport à la perméabilité de traceur relativement importante molécules 1,14,15. En général, les preuves de traceur couplage suggère fortement la présence de fonctionnement, ouvrir des canaux de jonction lacunaire, mais sous certaines conditions physiologiques, la diffusion traceur peut pas se produire ou être observée même si les enregistrements électrophysiologiques suggèrent la présence de fonctionnement, les jonctions ouvertes. Il semble probable que la technique du cut-chargement peut également être utilisé pour étudier l&#39;ampleur du couplage traceur écart de jonction entre les neurones dans le tissu intact depuis d&#39;autres régions du système nerveux centralTEM.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Société </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires (optionnel) </td></tr><tr><td> Méthanesulfonate de tricaïne (MS222) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A5040 </td><td> 150 mg / L d&#39;eau du réservoir tampon de poisson </td></tr><tr><td> Uréthane </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> U2500 </td><td> 2 g / dose kgloading </td></tr><tr><td> Double lunettes de vision nocturne Tube </td><td> Nuit Optique Unis </td><td> D-221 </td><td></td></tr><tr><td> Papier filtre, n ° 4 e année </td><td> Whatman </td><td> 1004-090 </td><td></td></tr><tr><td> Pinces fines, Dumont n ° 5, Biologie, 11 cm de long </td><td> Outils Fine Science </td><td> 11295-10 </td></tr><tr><td> Ciseaux fins, à ressort, lame 8 mm, droit </td><td> Outils Fine Science </td><td> 15025-10 </td><td></td></tr&gt; <tr><td> Neurobiotin </td><td> Vecteur </td><td> SP-1120 </td><td> 0,5% </td></tr><tr><td> Streptavidine conjuguée à Alexa 488 </td><td> Invitrogen </td><td> S11223 </td><td> 2% </td></tr><tr><td> Dextran rhodamine (élevé (&gt; 10 000) MW) </td><td> Invitrogen </td><td> D1817 </td><td> 0,5% </td></tr><tr><td> Vectashield milieu de montage </td><td> Vecteur </td><td> H-1000 </td><td></td></tr><tr><td> Zeiss 510 Laser META microscope confocal à balayage </td><td> Carl Zeiss, Inc </td><td></td><td></td></tr><tr><td> LSM-5 Image Browser 3,2,0,115 </td><td> Carl Zeiss, Inc </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Logiciel ImageJ </td><td> NIH </td><td></td><td></td></tr><tr><td> OriginPro 8.0 </td><td> OriginLab Corp </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

coupez-chargement: un outil utile pour examiner l&#39;étendue du couplage tracer gap jonction entre neurones rétiniens

Cut-loading: A Useful Tool for Examining the Extent of Gap Junction Tracer Coupling Between Retinal Neurons

En plus de la transmission synaptique chimique, les neurones qui sont connectés par des jonctions communicantes peuvent aussi communiquer rapidement via la transmission synaptique électrique. En plus de preuves indiquent que les jonctions non seulement permettent la circulation du courant électrique et l&#39;activité synchrone entre des cellules interconnectées ou couplés, mais que la force ou l&#39;efficacité de la communication électrique entre les cellules couplées peuvent être modulées à une grande mesure 1,2. En outre, le grand diamètre interne (~ 1,2 nm) de nombreux canaux de jonction lacunaire permet non seulement de flux de courant électrique, mais aussi la diffusion des molécules de signalisation intracellulaire et des métabolites de petites cellules interconnectées entre, de sorte que les jonctions de communication peut également servir de médiateur métaboliques et chimiques . La force de la communication entre les neurones jonctions lacunaires et sa modulation par les neurotransmetteurs et d&#39;autres facteurs peuvent être étudiés par l&#39;enregistrement simultanément électriquement à partir de cellules couplées et en déterminant tIl mesure la diffusion des molécules traceur, qui sont perméables jonction lacunaire, mais pas de membrane perméable, après l&#39;injection iontophorétique en cellules simples. Toutefois, ces procédures peuvent être extrêmement difficiles à réaliser sur les neurones avec des petits corps cellulaires dans le tissu neural intact. De nombreuses études sur les synapses électriques et la modulation de communication électrique ont été menées dans la rétine des vertébrés, puisque chacun des cinq types de neurones rétiniens est reliée électriquement par jonctions lacunaires 3,4. Plus de preuves a montré que le rythme circadien (24 heures) d&#39;horloge dans la rétine et des changements dans la stimulation lumineuse réguler jonction lacunaire couplage 3-8. Par exemple, des travaux récents ont démontré que l&#39;horloge circadienne rétine diminue raccord de jonction écart entre la tige et les cellules photoréceptrices cône pendant la journée, en augmentant l&#39;activation des récepteurs dopaminergiques D2, et augmente considérablement la tige-cône de couplage de la nuit en réduisant l&#39;activation du récepteur D2 <sup&gt; 7,8. Cependant, non seulement ces études extrêmement difficiles à réaliser sur les neurones avec des petits corps cellulaires intactes tissu rétinien de neurones, mais il peut être difficile de contrôler adéquatement les conditions d&#39;illumination pendant l&#39;étude électrophysiologique des neurones rétiniens simples pour éviter la lumière induit des changements dans la jonction lacunaire conductance. Ici, nous présentons une méthode simple de déterminer le degré de couplage traceur fossé jonction entre les neurones rétiniens dans des conditions d&#39;illumination différentes et à différents moments de la journée et la nuit. Cette technique du cut-chargement est une modification de chargement gratter 9-12, qui est basé sur le colorant de charge et de diffusion à travers l&#39;ouverture de canaux de jonction écart. Grattez de chargement fonctionne bien dans des cellules en culture, mais pas en tranches épaisses comme les rétines intactes. La technique du cut-chargement a été utilisée pour étudier couplage des photorécepteurs dans les poissons et les mammifères intactes des rétines 7, 8,13, et peut être utilisé pour étudier le couplage entred&#39;autres neurones de la rétine, comme décrit ici.

Une méthode facile et pratique pour déterminer l&#39;étendue de couplage traceur fossé jonction entre les neurones rétiniens est décrite. Cette technique permet d&#39;étudier la fonction des synapses électriques entre les neurones dans la rétine intacte sous différentes conditions d&#39;éclairage et à différents moments de la journée et la nuit.

Coupez-chargement: Un outil utile pour examiner l&#39;étendue du couplage Tracer Gap jonction entre neurones rétiniens

En plus de la transmission synaptique chimique, les neurones connectés par des jonctions communicantes peuvent également communiquer rapidement via des synapses électriques...

L'objectif général de l'expérience de chargement par coupure suivante est d'examiner le degré de couplage par jonctions communicantes entre les neurones de la rétine intacte dans des conditions contrôlées d'illumination. La première étape consiste à inciser les rétines à l’aide d’une lame fine trempée dans une solution de neurobiotine, une molécule traceuse capable de diffuser à travers les jonctions communicantes ouvertes, mais pas à travers les membranes cellulaires. Dans la deuxième étape, les rétines sont incubées dans une solution de Ringer, ce qui permet la diffusion du traceur à travers les jonctions communicantes ouvertes.Si le couplage par jonctions gap est faible, la fluorescence de la neurobiotine sera limitée aux neurones rétiniens situés près de la coupure. En revanche, si le couplage par jonctions gap est fort, la fluorescence sera détectée dans des neurones rétiniens éloignés de la coupure. Le principal avantage du chargement par coupure par rapport aux techniques existantes est qu'il est plus facile à réaliser sur des neurones ayant de petits corps cellulaires dans un tissu rétinien neural intact.Il est également plus facile de contrôler les conditions d'illumination pendant le chargement par coupe que lors d'une étude électrophysiologique de neurones individuels dans un tissu rétinien intact. Étant donné que les stimulations lumineuses utilisées pendant l'enregistrement électrique peuvent elles-mêmes induire des modifications du couplage par jonctions gap, la démonstration de la technique sera assurée par le Dr Chu Choi, postdoctorant de mon laboratoire. Dans cette procédure, un poisson rouge est maintenu en obscurité constante pendant la journée, au moins une heure avant la chirurgie, et toutes les étapes suivantes jusqu'à la fixation du tissu rétinien sont également réalisées en journée en obscurité constante ; anesthésiez profondément le poisson rouge en ajoutant 150 milligrammes par litre de méthane sulfonate à l'eau de l'aquarium.Ensuite, sacrifier le poisson rouge conformément aux directives fédérales et universitaires et retirer soigneusement ses globes oculaires. Puis, retirer la partie antérieure de chaque globe oculaire. Placez ensuite un morceau de papier filtre sur la partie postérieure de l’œil et retournez le papier filtre et l’œil de sorte que le papier filtre se retrouve sous la partie postérieure de l’œil.Maintenant, retirez délicatement la partie postérieure de l’œil, y compris la sclérotique et l’épithélium pigmentaire, du poisson rouge préalablement adapté à l’obscurité. Coupez le nerf optique à l’aide d’une paire de ciseaux fins. La rétine nerveuse du poisson rouge, orientée avec la face des photorécepteurs vers le haut, doit désormais être fixée sur du papier filtre avant l’énucleation, tandis que le poisson est sous anesthésie, dans 5 millilitres de solution de Ringer au carbonate oxygénée, avec ou sans médicament test, ajoutée dans chaque puits d’une plaque à six puits, après la dissection de la rétine nerveuse intacte de la partie postérieure de l’œil.Transférez les rétines dans les puits en maintenant l'obscurité constante. Scellez ensuite les puits avec du paraforme et laissez le tissu incuber pendant 30 minutes. Préparez 100 microlitres de solution traceuse en dissolvant 0,5 % de neurobiotine dans une solution de Ringer juste avant de sectionner la rétine.Ensuite, ajoutez la solution de biotine neuronale dans une boîte de Pétri en verre. Puis, tapez doucement le papier filtre auquel est fixée la rétine sur une serviette en papier. Pour éliminer l'excès de Ringer, trempez une lame de rasoir dans la solution de biotine neuronale et effectuez une incision radiale perpendiculaire à travers la rétine et le papier filtre.Ensuite, plongez à nouveau la lame de rasoir dans la solution de biotine neuro et coupez la rétine une deuxième fois. Répétez cette opération jusqu'à quatre coupes par rétine. À cette étape, transférez la rétine dans une solution saline fraîche, avec ou sans médicament test, pendant 15 minutes afin de permettre le chargement et la diffusion.Lavez-le trois fois avec une solution fraîche de Ringer, milieu avec ou sans médicament test pendant cinq minutes chacun. Ensuite, fixez la rétine avec du paraformaldéhyde à 4 % dans une solution tampon phosphate 0,1 molaire pendant une heure à température ambiante. Par la suite, lavez la rétine avec du PBS 0,1 molaire toute la nuit à quatre degrés Celsius en la plaçant dans un réfrigérateur le jour suivant.Faites réagir la rétine avec de la streptavidine Alexa 488 à 2 % dans du PBS 0,1 M et du Triton X-100 à 0,3 % pour obtenir une concentration finale de 10 microgrammes par millilitre, puis incubez toute la nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain, lavez la rétine trois fois avec du PBS 0,1 M à température ambiante, chaque lavage durant 10 minutes.Détacher la rétine du papier filtre dans le PBS. Ensuite, à l’aide d’un pinceau fin, monter la rétine côté photorécepteurs vers le haut sur une lame à l’aide d’un milieu de montage Vector Shield. Transférer la lame vers un microscope confocal à balayage laser et prendre des images avec le même grossissement, la même résolution et les mêmes paramètres pour chaque condition expérimentale, afin de permettre des comparaisons des effets de différentes conditions expérimentales sur l’importance du couplage fonctionnel par traceur de type gap.Voici l'étendue du couplage des cellules photoréceptrices marquées par le traceur pendant la journée en obscurité constante, comparée à celle observée pendant la journée en obscurité constante en présence d'un antagoniste sélectif du récepteur D2 de la dopamine. Remarquez que la coupe au rasoir dans les deux images se trouve à gauche. Bien qu'une seule image puisse contenir toutes les cellules marquées, il est recommandé d'acquérir une pile Z de la région d'intérêt et de la projeter en une image unique présentée ici.Voici l'étendue du couplage des traceurs dans les cellules photoréceptrices lorsqu'on progresse séquentiellement à travers un tel Zack. Notez que la coupe au rasoir sur cette image se trouve à droite. Pour quantifier l'étendue du couplage du traceur dans le navigateur d'images LSM, ouvrez l'image, puis cliquez sur exporter et enregistrez l'image sous forme de fichier TIF 16 bits non compressé ; la barre d'échelle doit être incluse dans cette image TIF à l'aide du logiciel NIH Image J.Mesurez l'intensité de fluorescence de la neurobiotine marquée par Alexa 488 à partir d'images de rétines montées en sandwich prises avec un faible grossissement. Ouvrez le fichier TIFF à l'aide du logiciel ImageJ, puis tracez une ligne droite correspondant à la barre d'échelle. Ensuite, accédez à Analyser, définissez l'échelle, puis saisissez la distance connue et l'unité de longueur.Ensuite, cliquez sur OK. Les mesures de fluorescence peuvent désormais être affichées en unités calibrées telles que les millimètres. Sélectionnez ensuite la zone d’intérêt à l’aide de l’outil de sélection rectangulaire.Le pic de fluorescence doit être positionné au bord gauche de votre sélection. Assurez-vous qu'aucun signal de fluorescence ne se trouve près du bord droit. Cliquez sur analyser et tracer le profil pour les données témoins de jour obtenues en obscurité constante.Une courbe présentant une décroissance exponentielle s'affiche de gauche à droite. Cliquez ensuite sur copier dans la fenêtre contextuelle et collez-la dans Excel. Deux colonnes apparaissent désormais : l'une indiquant la distance par rapport à l'incision, et l'autre indiquant l'intensité de fluorescence en fonction de la distance par rapport à l'incision.À titre de comparaison, les étapes ci-dessus sont répétées avec des données obtenues en obscurité constante dans la journée. En présence de spit bro, divisez chaque valeur de fluorescence brute par la valeur maximale de fluorescence afin d'obtenir l'intensité relative de fluorescence. Copiez deux colonnes correspondant à la distance par rapport à la coupe et à l'intensité relative de fluorescence, puis collez-les dans le logiciel Origin.Ces étapes sont illustrées à la fois pour le témoin diurne et pour le prélèvement diurne. Analyser les données à ce stade en ajustant les résultats à une fonction de décroissance exponentielle. Comparer les valeurs de la constante spatiale dans différentes conditions expérimentales à l'aide d'un test T ou d'un Inova.Des fonctions exponentielles et des analyses statistiques des données de contrôle diurnes, de pipéridone diurne et de contrôle nocturnes sont présentées à titre comparatif. Voici des exemples de l'importance du couplage des photorécepteurs marqués par un traceur dans la rétine de gardon adaptée à l'obscurité, pendant la journée A, la nuit B, et durant la journée en présence d'un antagoniste sélectif du récepteur D2 de la dopamine, tel que révélé par la technique de chargement par coupe. Toutes les images de microscopie confocale ont été obtenues avec les mêmes paramètres, afin de permettre la comparaison.Dans ce graphique, l'intensité de fluorescence pour trois conditions expérimentales est représentée en fonction de la distance par rapport à la coupure et ajustée à l'aide d'une fonction exponentielle. La technique de chargement par coupure est utilisée pour quantifier le degré de couplage par transfert de traceur via les jonctions gap en calculant les valeurs de la constante de distance, comme illustré ici pour trois conditions expérimentales. Cette technique peut également être employée pour étudier les synapses électriques entre d'autres types cellulaires dans la rétine et chez d'autres espèces.Par exemple, ces deux figures illustrent que les cellules horizontales de type A et de type B du lapin présentent un couplage homologue au traceur après chargement par coupure et diffusion de la neurobiotine dans des conditions de noirceur adaptée. Nous avons utilisé la technique de chargement par coupure pour étudier l'ampleur de la diffusion du traceur à travers les jonctions gap entre les bâtonnets et les cônes pendant la journée et la nuit. En outre, cette technique peut être utilisée pour déterminer si le couplage au traceur entre d'autres neurones rétiniens est contrôlé par l'horloge rétinienne et/ou par des conditions lumineuses spécifiques d'alternance clair-obscurité.Il peut également être utilisé pour étudier le couplage par traceur entre les neurones dans d'autres régions cérébrales.

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