Coupez-chargement: Un outil utile pour examiner l'étendue du couplage Tracer Gap jonction entre neurones rétiniens

L’objectif général de l’expérience de chargement de coupure suivante est d’examiner l’étendue du couplage du traceur de jonction lacunaire entre les neurones de la rétine intacte dans des conditions d’éclairage contrôlé. La première étape est réalisée en coupant les rétines avec une lame tranchante trempée dans une solution de neurobiotine, une molécule traceuse qui peut diffuser à travers des canaux de jonction à espace ouvert, mais pas les membranes cellulaires. Dans la deuxième étape, les rétines sont incubées dans la solution de Ringer, ce qui permet la diffusion du traceur à travers des canaux de jonction à espace ouvert.

Si le couplage de la jonction lacunaire est faible, la fluorescence de la neurobiotine sera limitée aux neurones rétiniens qui se trouvent près de la coupure. En revanche, si le couplage des jonctions lacunaires est fort, la fluorescence sera détectée dans les neurones rétiniens loin de la coupure. Le principal avantage de la charge coupée par rapport aux techniques existantes est qu’elle est plus facile à réaliser sur des neurones avec de petits corps cellulaires dans un tissu rétinien neural intact.

Il est également plus facile de contrôler les conditions d’éclairage lors de la charge de coupe que lors d’une étude électrophysiologique de neurones uniques dans un tissu rétinien intact. Parce que les stimuli lumineux utilisés pendant l’enregistrement électrique peuvent eux-mêmes entraîner des changements dans le couplage des jonctions lacunaires, la démonstration de la technique sera le Dr Chu Choi, postdoctorant de mon laboratoire. Dans cette procédure, un poisson rouge est maintenu dans l’obscurité constante pendant la journée pendant au moins une heure avant l’opération, et toutes les étapes suivantes jusqu’à ce que le tissu rétinien soit fixé, sont également effectuées pendant la journée dans l’obscurité constante, anesthésient profondément le poisson rouge en ajoutant 150 milligrammes par litre de sulfonate de méthane à l’eau de l’aquarium.

Ensuite, sacrifiez le poisson rouge selon les directives fédérales et universitaires et retirez soigneusement ses globes oculaires. Ensuite, retirez la partie antérieure de chaque globe oculaire. Placez ensuite un morceau de papier filtre sur la partie postérieure de l’œil et inversez le papier filtre et l’œil de sorte que le papier filtre se trouve sous la partie postérieure de l’œil.

Maintenant, retirez doucement l’arrière de l’œil, y compris la sclérotique et l’épithélium pigmentaire du poisson rouge adapté à l’obscurité. La rétine a coupé le nerf optique avec une paire de ciseaux fins. Le poisson rouge neural, côté photorécepteur orienté vers le haut, doit maintenant être attaché au papier filtre avant l’énucléation, tandis que le poisson subit une anesthésie à cinq millilitres oxygénée par une solution de ringer à base de carbonate avec ou sans médicament d’essai à chaque puits d’une plaque à six puits après dissection de la rétine neurale intacte de la partie postérieure de l’œil.

Transférez les rétines dans les puits pendant l’obscurité constante. Scellez ensuite les puits avec du paraform et laissez le tissu incuber pendant 30 minutes. Préparez 100 microlitres de solution de traceur en dissolvant 0,5 % de biotine neuro dans une solution de ringer immédiatement avant de couper à travers la rétine.

Ensuite, ajoutez la solution de neurobiotine dans une boîte de Pétri en verre. Tapotez ensuite doucement le papier filtre auquel la rétine est fixée sur une serviette en papier. Pour éliminer l’excès de sonneries, trempez une lame de rasoir dans la solution de neurobiotine et faites une coupe radiale perpendiculaire à travers la rétine et le papier filtre.

Après cela, trempez à nouveau la lame de rasoir dans la solution de neurobiotine et coupez la rétine une deuxième fois. Répétez cette opération jusqu’à quatre incisions par rétine. À cette étape, transférez la rétine dans des bagues fraîches, un milieu avec ou sans médicament d’essai pendant 15 minutes pour permettre le chargement et la diffusion.

Lavez-le trois fois avec des bagues fraîches, moyennes avec ou sans médicament d’essai pendant cinq minutes chacune. Fixez ensuite la rétine avec du paraformaldéhyde à 4 % dans une solution tampon de phosphate à 0,1 molaire à température ambiante pendant une heure. Par la suite, lavez la rétine avec 0,1 molaire de PBS pendant la nuit à quatre degrés Celsius en la plaçant dans un réfrigérateur le lendemain.

Faites réagir la rétine avec 2 % de streptavidine Alexa 4 88 dans 0,1 molaire PBS et 0,3 % Triton X 100 à une concentration finale de 10 microgrammes par millilitre et incubé pendant une nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain. Lavez la rétine trois fois avec 0,1 molaire de PBS à température ambiante à chaque fois pendant 10 minutes.

Détachez la rétine du papier filtre dans le PBS. Ensuite, à l’aide d’un pinceau fin, montez le côté photorécepteur de la rétine vers le haut sur une lame avec un support de montage à écran vectoriel. Transférez la lame sur un microscope confocal à balayage laser et prenez des photos avec le même grossissement, la même résolution et les mêmes paramètres pour chaque condition expérimentale afin que des comparaisons des effets de différentes conditions expérimentales sur l’étendue du couplage de traceur fonctionnel d’espace puissent être montrées.

Voici l’étendue du couplage des traceurs cellulaires photorécepteurs pendant la journée dans l’obscurité constante par rapport à la journée dans l’obscurité constante en présence d’un antagoniste sélectif des récepteurs de la dopamine D deux. Notez que la coupe au rasoir dans les deux images se trouve à gauche. Bien qu’une seule image puisse contenir toutes les cellules étiquetées, il est recommandé de collecter une pile Z de la zone d’intérêt et de la réduire en une seule image.

Voici l’étendue du couplage des traceurs cellulaires photorécepteurs lorsque l’on se déplace séquentiellement à travers un tel Zack. Notez que la coupe au rasoir sur cette image se trouve à droite. Pour quantifier l’étendue du couplage de traceur dans le navigateur d’images LSM, ouvrez l’image, puis cliquez sur Exporter et enregistrez l’image en tant que fichier TIF 16 bits non compressé : la barre d’échelle doit être incluse dans cette image TIFF à l’aide du logiciel NIH image J.

Mesurez l’intensité de fluorescence de la neurobiotine marquée par Alexa 4 88 à partir d’images à faible grossissement de rétines montées par trous. Ouvrez le fichier TIFF à l’aide du logiciel Image J, puis tracez une ligne droite correspondant à la barre d’échelle. Ensuite, allez analyser, définir l’échelle et entrez la distance et l’unité de longueur connues.

Cliquez ensuite sur OK. Désormais, les mesures de fluorescence peuvent être présentées en unités calibrées telles que le millimètre. Ensuite, sélectionnez la zone d’intérêt à l’aide de l’outil de sélection rectangulaire.

Le pic de fluorescence doit être positionné sur le bord gauche de votre sélection. Assurez-vous qu’il n’y a pas de signal fluorescent près du bord droit. Cliquez sur Analyser et tracez le profil pour les données de contrôle diurnes obtenues dans l’obscurité constante.

Une courbe avec une décroissance exponentielle est affichée de gauche à droite. Cliquez ensuite sur copier dans la fenêtre contextuelle et collez-le dans Excel. Il y a maintenant deux colonnes, l’une indiquant la distance de la coupe et l’autre montrant l’intensité de fluorescence en fonction de la distance de la coupe.

À titre de comparaison, les étapes ci-dessus sont répétées avec des données obtenues dans l’obscurité constante pendant la journée. En présence de crachat, divisez chaque valeur de fluorescence brute par la valeur de fluorescence maximale pour obtenir l’intensité de fluorescence relative. Copiez deux colonnes correspondant à la distance de la coupe et à l’intensité de fluorescence relative, puis collez-les dans le logiciel d’origine.

Ces étapes sont illustrées à la fois pour la commande diurne et la broche diurne. À ce stade, les données d’exécution correspondent aux résultats avec la décroissance exponentielle. La fonction numéro un, comparez les valeurs de la constante d’espace dans différentes conditions expérimentales à l’aide d’un test T ou d’Inova.

Des fonctions exponentielles et des analyses statistiques des données de contrôle diurne, de pip rone diurne et de contrôle nocturne sont présentées à des fins de comparaison. Montré. Voici des exemples de l’étendue du couplage des traceurs cellulaires photorécepteurs dans l’obscurité adapté à la rétine du poisson rouge le jour A, la nuit B et le jour en présence d’un antagoniste sélectif des récepteurs de la dopamine D à deux, comme révélé par la technique de chargement de coupe. Toutes les images confocales ont été prises en utilisant les mêmes paramètres de comparaison.

Dans ce graphique, l’intensité de fluorescence pour trois conditions expérimentales est tracée en fonction de la distance de la coupe et ajustée par la fonction exponentielle. La technique de chargement de coupe est utilisée pour quantifier l’étendue du couplage du traceur jonctionnel intersticulaire en calculant les valeurs de constante d’espace comme indiqué ici pour trois conditions expérimentales. La technique de chargement coupé peut également être utilisée pour étudier les synapses électriques entre d’autres types de cellules dans la rétine et chez d’autres espèces.

Par exemple, ces deux figures illustrent que les cellules horizontales de lapin, de type A et de type B, présentent un couplage traceur homologue suivant, une charge coupée et une diffusion de la neurobiotine dans des conditions sombres adaptées. Nous avons utilisé la technique de chargement par coupe pour étudier l’étendue de la diffusion du traceur à travers les jonctions intersticables entre les barres et les cônes de jour comme de nuit. De plus, cette technique peut être utilisée pour déterminer si le couplage du traceur entre d’autres neurones rétiniens est contrôlé par l’horloge rétinienne et/ou par des conditions spécifiques de lumière sombre.

Il peut également être utilisé pour étudier le couplage des traceurs entre les neurones d’autres régions du cerveau.