Name: Expansion du sang périphérique humain cellules T γδ utilisant zolédronate (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 8 s
Description: Découvrez l'expansion des cellules T γδ du sang périphérique humain utilisant le zolédronate et l'IL-2 pour l'immunothérapie cellulaire anticancéreuse. Cette méthode clinique permet une prolifération efficace en 14 jours.

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1. Isolation des PBMC <ol><li> Prélever le sang (7,5 à 8,0 ml) dans un tube BD Vacutainer CPT Préparation des cellules avec de l'héparine de sodium. Le tube contient un anticoagulant héparine sodique et d'un fluide de densité Ficoll-Hypaque, plus une barrière de gel de polyester, qui sépare les deux liquides. Centrifuger le tube / échantillon de sang à température ambiante (18 ° C à 25 ° C) dans un rotor horizontal (swing-out tête) pendant 20 min à 1800 x g. Commutateur centrifugeuse freins hors tension. </li><li> Après centrifugation, la séquence de couches se produit comme suit (vu de haut en bas): un plasma) - b) les cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) et plaquettes - c) la solution de densité - gel de polyester d) - e) les granulocytes - f) globules rouges (fig. 1). </li><li> Recueillir une fraction de la couche de plasma, en laissant 5 à 10 mm de plasma au-dessus de l'interphase sans déranger la couche de cellules. Le plasma peut être utilisé pour la culture (article 2.5). </li><li> Récolte de la fraction enrichie (PBMC) à l'interphase avec une pipette et transférer dans un tube de 15 ml conique. </li><li> Laver les PBMC avec 10 ml de tampon phosphate salin (PBS), en inversant le tube 5 fois, puis centrifuger 5 min à 400 x g. </li><li> Répétez les étapes de lavage à deux reprises, puis remise en suspension le culot cellulaire dans 5 ml de PBS. Déterminer le nombre de cellules. Habituellement 1,3 x10 6 cellules sont récupérées à partir de 1 ml de sang total. </li><li> Déterminer la fréquence et le phénotype des cellules γδ T PBMC par cytométrie en flux (section 3) (Fig. 2). </li></ol> 2. L'expansion des cellules T γδ <ol><li> Centrifugeuse suspensions cellulaires dans 15 ml tubes coniques pendant 5 min à 400 x g à température ambiante, et jeter le surnageant. </li><li> Préparer un milieu de culture (CM) en ajoutant l'IL-2 humaine (IL-2) et le zolédronate (Zometa) à des concentrations finales de 1000 UI / ml et 5 uM, respectivement. ALyS203 (Cell Science &amp; Technology Institute) ou OpTmizer (Invitrogen) des médias de soutenir l'expansion des cellules T bonnes γδ (plus d'informations dans les références 6 et 9). Zometa est fourni sous forme liquide (4 flacon mg/5-ml). Pour préparer une solution à 5 uM, ajouter 50 ul de Zometa à 30 ml de milieu de culture. </li><li> Resuspendre le culot cellulaire dans un milieu de culture et de s'adapter à 1x10 6 cellules / ml. </li><li> Pipeter 1 ml de CM contenant 1x10 6 cellules dans chaque puits d'une plaque de 24 puits. Pour les grandes cultures, les cellules peuvent être ensemencées à 0,5 x 10 6 cellules / cm 2 selon la surface du puits de la plaque, plat, ou le flacon. </li><li> Ajouter plasma autologue (section 1.3), regroupés AB humain sérums ou FCS pour qu'il se trouve à environ 10% du volume de la culture (100 pi pour chaque puits d'une plaque de 24 puits). Placer les plaques dans un 37 humidifié ° C, 5% de CO 2 incubateur de 24-48 heures. </li><li> Maintenir la culture à une densité cellulaire de 0,5-2 x 10 6 cellules / ml. Ajouter un milieu frais contenant l'IL-2 humaine (1000 UI / ml) seule (sans Zometa) tous les 2-3 jours, et le transfert des cellules cultivées dans des puits nouveaux ou flacons que nécessaire, selon le degré de prolifération cellulaire (Fig. 3). Plasmatique d'alimentation ou de sérum dans le milieu de sorte que la concentration sérique peut être maintenu au moins 1%. </li><li> Récolte des cellules le jour 12-14 et déterminer la fréquence, le phénotype et les fonctions des cellules T γδ par cytométrie en flux (voir ci-dessous). </li></ol> 3. L'analyse phénotypique par cytométrie en flux <ol><li> Transfert de 200 échantillons ul contenant 2 x 10 5 cellules pour le tri de cellules activées par fluorescence (FACS) tubes. </li><li> Ajouter 2 ml de PBS froid et centrifuger 5 min à 400 x g. Ensuite, remettre en suspension les boulettes dans 50 ul de tampon FACS (PBS + 1% de FCS azoture de sodium + 0,1%). Ajouter 5 ul de chaque anticorps pour les échantillons (les anticorps monoclonaux sont énumérés dans le tableau 1). </li><li> Incuber sur de la glace dans l'obscurité pendant 20 min. </li><li> Ajouter 2 ml de tampon FACS à chaque échantillon, puis de vortex. Centrifuger les échantillons pendant 5 min à 400 x g à 4 ° C. Décanter avec précaution le surnageant. </li><li> Resuspendre les cellules dans 300 ul de tampon FACS et les vortex. Analyser des échantillons sur un cytomètre en flux (Fig. 2). </li></ol> 4. IFN-γ test de production 10 <ol><li> Le jour avant le dosage, préparer des cellules stimulatrices en cultivant 3-5 cellules Daudi x10 5 / ml dans du milieu RPMI 1640 plus 10% de FCS (RPMI-10) pendant la nuit avec Zometa (5 uM) (ci-après désignée Z-Daudi). </li><li> Recueillir Z-Daudi et remettre en suspension dans du RPMI-10 à 2x10 6 cellules / ml. Ajouter 100 ul de Z-Daudi (2x10 5) à chaque puits d'une plaque à fond rond de 96 puits. </li><li> Préparer les cellules T γδ au 2x10 6 cellules / ml dans du RPMI-10 contenant Bréfeldine A à 20 pg / ml. Transférer 100 ul de suspension cellulaire T γδ (2x10 5) à chaque puits contenant les cellules Daudi-Z ou de contrôler des puits (100 pl de RPMI-10 seulement, ou RPMI-10 avec 20 ng / ml de phorbol 12-myristate 13-acétate[PMA] et 2 pg / ml d'ionomycine). </li><li> Mélanger à la pipette et à plusieurs reprises. Incuber pendant 4 heures dans un 37 ° C, 5% de CO 2 incubateur. </li><li> Centrifuger la plaque pendant 5 min à 400 x g à 4 ° C et remettre les boulettes dans 200 ul de PBS froid. </li><li> Transférer les échantillons dans des tubes FACS. Ajouter 4 ml de PBS froid et centrifuger les tubes pendant 5 min à 400 x g à 4 ° C. </li><li> Resuspendre les culots dans 50 ul de tampon FACS avec FITC conjugué anti-TCRVγ9 (5 pi) et de PE/Cy5-conjugated anti-CD3 mAb (2,5 pi). Incuber abri de la lumière pendant 15 min à température ambiante. </li><li> Ajouter 100 ul de réactif IntraPrep 1 et incuber pendant 15 min à température ambiante. Ajouter 4 ml de PBS dans chaque tube et centrifuger 5 min à 400 x g à température ambiante. </li><li> Retirer le surnageant par aspiration et ajouter 100 l de réactif 2 IntraPrep. Incuber pendant 5 min à température ambiante sans agitation. </li><li> Ajouter 5 ul de PE-conjugué anti-IFN-γ mAb le tube à essai. Incuber abri de la lumière pendant 15 min à température ambiante. </li><li> Ajouter 4 ml de PBS dans chaque tube et centrifuger 5 min à 400 x g à température ambiante. Retirer le surnageant par aspiration et resuspendre le culot cellulaire dans 0,5 ml de tampon FACS. </li><li> Analyser les cellules par cytométrie en flux. Porte sur le CD3 + + TCRVγ9 cellules et d'examiner l'expression d'IFN-γ (Fig. 4). </li></ol> 5. Les résultats représentatifs: Il est important de déterminer le pourcentage de cellules T γδ dans PBMC à l'initiation de la culture. Comme le montre la Fig. 2 A, le pourcentage de cellules CD3 + + TCRVγ9 γδ lymphocytes T dans les PBMC a été de 1,6% au jour 0. Les populations dominantes étaient CD27 + CD45RA + CD27 + naïfs ou CD45RA - phénotypes mémoire centrale. Lorsque les cellules T γδ ont été stimulés efficacement, ils ont formé des grappes sur les jours 3-5 (Fig. 3 A et B). Lorsque la formation de grappes a été retardée, la croissance des autres types cellulaires, comme les cellules CD4 + ou CD8 + αβ des cellules T ou des cellules NK pourrait dominer la croissance des cellules T γδ (Fig. 3 C et D). Après 14 jours de culture, de la fréquence des cellules T γδ augmenté à plus de 93,8% des cellules cultivées dans des cultures de cellules γδ réussie T (fig. 2 E). La culture des cellules T γδ surexprimés NKG2D et expression de CD69 (fig. 2 G et H). Ils s'affichent CD27 - CD45RA - phénotype mémoire effecteurs (Fig. 2 F). Les fonctions des cellules T γδ ont été évalués à l'égard de la production de cytokines et la cytotoxicité. L'IFN-γ intracellulaire coloration démontré que les cellules T γδ IFN-γ produit en réponse au PMA / ionomycine traitement ou Z-Daudi cellules qui IPP ​​accumulés après le traitement zolédronate (fig. 4). Ces résultats indiquent que le zolédronate peut efficacement stimuler et de développer des cellules T γδ fonctionnelle. <table border="1"><tbody><tr><td> Tube </td><td> FITC </td><td> PE </td><td> DPE </td><td> PE/Cy5 </td></tr><tr><td> 1 </td><td> CD3 </td><td> CD19 </td><td> CD45 </td><td> CD14 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> CD3 </td><td> TCRap </td><td> CD4 </td><td> CD8 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> CD3 </td><td></td><td></td><td> CD56 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> TCR Vy9 </td><td> TCRap </td><td> CD45 </td><td> CD3 </td></tr><tr><td> 5 </td><td> TCR Vy9 </td><td> NKG2D </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 6 </td><td> TCR Vy9 </td><td> CD69 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 7 </td><td> TCR Vy9 </td><td> IgG1 de souris </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 8 </td><td> TCR Vy9 </td><td></td><td> CD45RA </td><td> CD27 </td></tr><tr><td> 9 </td><td> TCR Vy9 </td><td></td><td> IgG1 de souris </td><td> IgG1 de souris </td></tr></tbody></table> Tableau 1. Les anticorps monoclonaux utilisés dans la coloration des cellules T multicolores γδ. Un exemple de l'analyse phénotypique des cellules T γδ effectué dans notre laboratoire est montré dans la Fig. 2. <img src="/files/ftp_upload/3182/3182fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Séparation des PBMC. Sang (7,5 à 8,0 ml) est tiré dans un tube BD Vacutainer CPT Préparation des cellules avec de l'héparine de sodium et directement centrifugé pendant 20 min à 1800 x g. Après centrifugation, les couches résultant comme on le voit du haut vers le boTTOM: un écran plasma) - b) PBMC et plaquettes - solution de densité c) - gel de polyester d) - e) Granulocytes - f) Les globules rouges. <img src="/files/ftp_upload/3182/3182fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Phénotype de surface typiques des cellules T γδ. PBMC ont été stimulées avec le zolédronate et IL-2 pendant 14 jours. Les cellules ont été colorés avec marqué FITC anti-TCR Vy9 et PE/Cy5-labeled anti-CD3 pour surveiller l'expansion des cellules T γδ (A et E). Les cellules T γδ ont été identifiés par leur expression de TCRVγ9, et leur expression de CD27 et CD45RA (B et F), NKG2D (C et G), ou CD69 (D et H) a été examiné. <img src="/files/ftp_upload/3182/3182fig3.jpg" alt="Figure 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> Figure 3. Représentant γδ cultures de cellules T. PBMC ont été stimulées par l'IL-2 (1000 UI / ml) et le zolédronate (5 um). Champs représentatifs sont présentés (IX71 microscope inversé [Olympus] x 200). Les clusters et les agrégats de cellules T γδ peuvent être observés au jour 3 (A) et le jour 5 (B), lorsque les cellules T γδ ont été développé avec succès. En revanche, aucun amas ou d'agrégats ont été observés lorsque la croissance des cellules T γδ n'était pas adéquate (C et D). <img src="/files/ftp_upload/3182/3182fig4.jpg" alt="Figure 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 4"> Figure 4. IFN-γ production. Les cellules T γδ ont été incubées avec du RPMI-10 seulement (A) ou PMA / ionomycine (B) ou Z-Daudi (C) pendant 4 heures. Tout d'abord, l'expression de surface de TCRVγ9 était tachée et ensuite de l'IFN-γ de production a été examiné par l'IFN-γ intracellulaire coloration. <img src="/files/ftp_upload/3182/3182fig5.jpg" alt="Figure 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 5"> Figure 5. Cinétique de la culture de cellules γδ T. (A) Le nombre absolu de cellules cultivées, (B) le pourcentage de cellules T γδ, et (C) le nombre absolu de lymphocytes T γδ dans les points de temps indiqués.

<ol><li>Bonneville, M., O'Brien, R. L., Born, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B3+T+cell+effector+functions%3A+a+blend+of+innate+programming+and+acquired+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">γ T cell effector functions: a blend of innate programming and acquired plasticity.</a> Nat Rev Immunol. 10, 467-478 (2010).</li>
<li>Hintz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+%28E%29-4-hydroxy-3-methyl-but-2-enyl+pyrophosphate+as+a+major+activator+for+human+%CE%B3%CE%B4+T+cells+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Identification of (E)-4-hydroxy-3-methyl-but-2-enyl pyrophosphate as a major activator for human γδ T cells in Escherichia coli.</a> FEBS Lett. 509, 317-322 (2001).</li>
<li>Gober, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+T+cell+receptor+%CE%B3%CE%B4+cells+recognize+endogenous+mevalonate+metabolites+in+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Human T cell receptor γδ cells recognize endogenous mevalonate metabolites in tumor cells.</a> J Exp Med. 197, 163-168 (2003).</li>
<li>Kabelitz, D., Wesch, D., He, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspectives+of+gammadelta+T+cells+in+tumor+immunology%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Perspectives of gammadelta T cells in tumor immunology.</a> Cancer Res. 67, 5-8 (2007).</li>
<li>Roelofs, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+blood+monocytes+are+responsible+for+gammadelta+T+cell+activation+induced+by+zoledronic+acid+through+accumulation+of+IPP%2FDMAPP%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Haematol%22%5BJournal%5D)">Peripheral blood monocytes are responsible for gammadelta T cell activation induced by zoledronic acid through accumulation of IPP/DMAPP.</a> Br J Haematol. 144, 245-250 (2009).</li>
<li>Dieli, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+%CE%B3%CE%B4+T-lymphocyte+effector+functions+by+bisphosphonate+zoledronic+acid+in+cancer+patients+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Induction of γδ T-lymphocyte effector functions by bisphosphonate zoledronic acid in cancer patients in vivo.</a> Blood. 102, 2310-2311 (2003).</li>
<li>Kondo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zoledronate+facilitates+large-scale+ex+vivo+expansion+of+functional+%CE%B3%CE%B4+T+cells+from+cancer+patients+for+use+in+adoptive+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Zoledronate facilitates large-scale ex vivo expansion of functional γδ T cells from cancer patients for use in adoptive immunotherapy.</a> Cytotherapy. 10, 842-856 (2008).</li>
<li>Espinosa, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+synthesis+and+biological+activity+of+bromohydrin+pyrophosphate%2C+a+potent+stimulator+of+human+%CE%B3%CE%B4+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Chemical synthesis and biological activity of bromohydrin pyrophosphate, a potent stimulator of human γδ T cells.</a> J Biol Chem. 276, 18337-18344 (2001).</li>
<li>Kobayashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+profile+and+anti-tumor+effects+of+adoptive+immunotherapy+using+%CE%B3%CE%B4+T+cells+against+advanced+renal+cell+carcinoma%3A+a+pilot+study%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunol+Immunother%22%5BJournal%5D)">Safety profile and anti-tumor effects of adoptive immunotherapy using γδ T cells against advanced renal cell carcinoma: a pilot study.</a> Cancer Immunol Immunother. 56, 469-476 (2007).</li>
<li>Murali-Krishna, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counting+antigen-specific+CD8+T+cells%3A+a+reevaluation+of+bystander+activation+during+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Counting antigen-specific CD8 T cells: a reevaluation of bystander activation during viral infection.</a> Immunity. 8, 177-187 (1998).</li>
<li>Sato, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+culture+medium+on+the+expansion+of+T+cells+for+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Impact of culture medium on the expansion of T cells for immunotherapy.</a> Cytotherapy. 11, 936-946 (2009).</li>
<li>Abe, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+and+immunological+evaluation+of+zoledronate-activated+V%CE%B39+%CE%B3%CE%B4T-cell-based+immunotherapy+for+patients+with+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Hematol%22%5BJournal%5D)">Clinical and immunological evaluation of zoledronate-activated Vγ9 γδT-cell-based immunotherapy for patients with multiple myeloma.</a> Exp Hematol. 37, 956-968 (2009).</li>
<li>Nakajima, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phase+I+study+of+adoptive+immunotherapy+for+recurrent+non-small-cell+lung+cancer+patients+with+autologous+%CE%B3%CE%B4+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Cardiothorac+Surg%22%5BJournal%5D)">A phase I study of adoptive immunotherapy for recurrent non-small-cell lung cancer patients with autologous γδ T cells.</a> Eur J Cardiothorac Surg. 37, 1191-1197 (2010).</li>
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Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

La méthode présentée ici permet l&#39;expansion efficace des cellules T γδ partir des PBMC. γδ cellules T activées et élargies par le zolédronate et IL-2 développent complète des fonctions effectrices, reflétée par la production de cytokines et la cytotoxicité. Il a été rapporté que le pyrophosphate bromhydrine synthétiques phosphoantigènes (BrHPP) et le 2-méthyl-3-butényle-1-pyrophosphate (2M3B1PP) élargira également les cellules T γδ, mais ils ne sont pas disponibles dans le commerce. En revanche, le zolédronate est d...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du réactif </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commentaires (optionnel) </th></tr><tr><td> ZOMETA </td><td> Novartis Pharma K. K </td><td></td><td> zolédronate </td></tr><tr><td> PROLEUKIN </td><td> Novartis Pharmaceuticals </td><td></td><td> IL-2 humaine recombinante </td></tr><tr><td> BD Vacutainer CPT Tube Préparation des cellules avec de l&#39;héparine de sodium </td><td> BD </td><td> 362753 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI1640 </td><td> Invitrogen </td><td> 21870-076 </td><td></td></tr><tr><td> ALyS203 moyennes </td><td> Cellule Science &amp; Technology Institute </td><td> 0301-7 </td><td></td></tr><tr><td> OpTmizer </td><td> Invitrogen </td><td> 0080022SA </td><td></td></tr><tr><td> Un bréfeldine </td><td> Sigma </td><td> B5936-200UL </td><td></td></tr><tr><td> phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA) </td><td> Sigma </td><td> P1585-1MG </td><td></td></tr><tr><td> ionomycine </td><td> Sigma </td><td> 13909-1ML </td><td></td></tr><tr><td> IntraPrep </td><td> BECKMAN COULTER </td><td> A07803 </td><td></td></tr><tr><td> anti-humain CD3-FITC ou PE/Cy5 </td><td> BECKMAN COULTER </td><td> A07746 FITC A07749 PE/Cy5 </td><td></td></tr><tr><td> anti-CD4 humain DPE </td><td> BECKMAN COULTER </td><td> 6604727 </td><td></td></tr><tr><td> anti-humain CD8-PE/Cy5 </td><td> BECKMAN COULTER </td><td> 6607011 </td><td></td></tr><tr><td> anti-humain CD14-PE/Cy5 </td><td> BECKMAN COULTER </td><td> A07765 </td><td></td></tr><tr><td> anti-humain CD19-PE </td><td> BECKMAN COULTER </td><td> A07769 </td><td></td></tr><tr><td> anti-humain CD45-ECD </td><td> BECKMAN COULTER </td><td> A07784 </td><td></td></tr><tr><td> anti-humain CD56-PE/Cy5 </td><td> BECKMAN COULTER </td><td> A07789 </td><td></td></tr><tr><td> anti-humain TCRap-PE </td><td> BECKMAN COULTER </td><td> A39499 </td><td></td></tr><tr><td> TCR anti-humaine-FITC Vy9 </td><td> BECKMAN COULTER </td><td> IM1463 </td><td></td></tr><tr><td> anti-humain CD27-PE/Cy5 </td><td> BECKMAN COULTER </td><td> 6607107 </td><td></td></tr><tr><td> anti-humain CD45RA-DPE </td><td> BECKMAN COULTER </td><td> IM2711 </td><td></td></tr><tr><td> anti-humain CD69-PE </td><td> BD </td><td> 555531 </td><td></td></tr><tr><td> anti-humain NKG2D-PE </td><td> BECKMAN COULTER </td><td> A08934 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-humal IFN-PE </td><td> BECKMAN COULTER </td><td> IM2717U </td><td></td></tr><tr><td> Souris IgG1 isotype contrôle-PE </td><td> BECKMAN COULTER </td><td> A07796 </td><td></td></tr><tr><td> Souris IgG1 isotype contrôle-ECD ou PE/Cy5 </td><td> BECKMAN COULTER </td><td> A07797 A07798 </td><td></td></tr></tbody></table>

expansion du sang périphérique humain cellules t γδ utilisant zolédronate

Expansion of Human Peripheral Blood  &gamma;&delta; T Cells using Zoledronate

L&#39;homme des cellules T γδ peuvent reconnaître et répondre à une grande variété de stress induit par les antigènes, développant ainsi une large activité innée anti-tumorale et anti-infectieux. 1 La majorité des cellules T γδ dans le sang périphérique ont le récepteur des cellules T Vγ9Vδ2. Ces cellules reconnaissent un antigène dans un complexe d&#39;histocompatibilité majeure manière indépendante et de développer de solides cytolytique et Th1-like fonctions effectrices. 1 Par conséquent, γδ lymphocytes T sont des cellules effectrices candidat intéressant pour l&#39;immunothérapie du cancer. Vγ9Vδ2 cellules T de répondre à phosphoantigènes tel que (E)-4-hydroxy-3-méthyl-but-2-ényle pyrophosphate (HMBPP), ce qui est synthétisée dans la bactérie via la biosynthèse des isoprénoïdes; 2 et isopentényl pyrophosphate (IPP), qui est produite dans les cellules eucaryotes par la voie du mévalonate. 3 Dans l&#39;état physiologique, la génération des IPP dans la cellule non transformée n&#39;est pas suffisant pour l&#39;activation des cellules T γδ. Le dérèglement de voie du mévalonate dans les cellules tumorales conduit à l&#39;accumulation des IPP et γδ lymphocytes T d&#39;activation. 3 Parce aminobisphosphonates (comme le pamidronate ou zolédronate) inhibent farnésyl pyrophosphate synthase (FPPS), l&#39;enzyme agissant en aval de la PIP dans la voie du mévalonate, les taux intracellulaires de IPP et sensitibity aux cellules T γδ reconnaissance peut être thérapeutique augmenté de aminobisphosphonates. IPP accumulation est moins efficace dans les cellules nontransfomred que des cellules tumorales avec une concentration pharmacologiquement pertinentes de aminobisphosphonates, qui nous permettent d&#39;immunothérapie pour le cancer en activant les cellules T γδ avec aminobisphosphonates 4. Fait intéressant, IPP s&#39;accumule dans les monocytes lors PBMC sont traitées avec aminobisphosphonates, en raison de l&#39;efficacité l&#39;absorption des médicaments par ces cellules. 5 monocytes qui s&#39;accumulent IPP deviennent cellules présentatrices d&#39;antigène et stimuler Vγ9Vδ2 cellules T dans le sang périphérique. 6 Basé sur ces mécanismes, nous avons développé une technique à grande échelle l&#39;expansion des cultures de cellules T γδ utilisant zolédronate et l&#39;interleukine -2 (IL-2). 7 D&#39;autres méthodes pour l&#39;expansion des cellules T γδ utiliser le pyrophosphate bromhydrine synthétiques phosphoantigènes (BrHPP) 8 ou 2-méthyl-3-butényle-1-pyrophosphate (2M3B1PP) 9. Toutes ces méthodes permettent ex l&#39;expansion in vivo, ce qui entraîne un grand nombre de cellules T γδ pour une utilisation en immunothérapie adoptive. Toutefois, seul le zolédronate est un réactif approuvé par la FDA disponible commercialement. Zolédronate-élargi γδ lymphocytes T CD27 écran - CD45RA - phénotype mémoire effecteurs et leur fonction peut être évaluée par l&#39;IFN-γ test de production 7.

Une méthode pour développer des cellules T γδ à partir des cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) est décrite. PBMC dérivés des lymphocytes T γδ sont stimulés et étendu en utilisant le zolédronate et l&#39;interleukine-2 (IL-2). L&#39;expansion à grande échelle de cellules T γδ peuvent être appliquées à l&#39;immunothérapie cellulaire autologue de cancer.

Expansion du sang périphérique humain cellules T γδ utilisant zolédronate

Les lymphocytes T $\gamma\delta$ humains peuvent reconnaître et répondre à une grande variété d'antigènes induits par le stress, développant ainsi une réponse antitumorale innée large et...

Ce vidéo montre l'expansion à grande échelle de cellules T gamma delta provenant du sang périphérique humain à l'aide de zolédronate. Tout d'abord, le sang total est soumis à une centrifugation en gradient de densité afin d'isoler les cellules mononucléées du sang périphérique, ou PBMC. Les PBMC sont stimulés par le zolédronate, ce qui induit la transformation des monocytes en cellules présentatrices d'antigènes, ainsi que par l'IL-2 afin de stimuler les cellules T gamma delta.Les cellules sont incubées jusqu'à 14 jours afin de favoriser la prolifération des lymphocytes T gamma delta. L'analyse de la culture par cytométrie en flux montre que la majorité des cellules récoltées présentent un phénotype CD trois positif V gamma neuf positif. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes est qu'elle est déjà autorisée pour des applications cliniques avec Zometa.Par conséquent, un réactif fiable est facilement disponible pour la préparation clinique de lymphocytes T gamma delta, ce qui montre que la procédure sera une culture cellulaire makoto condo et amichi izumi. Les techniciens de mon laboratoire commencent cette procédure en isolant les cellules mononucléées du sang périphérique à partir de sang total recueilli dans un tube de préparation cellulaire BD Vacutainer CPT contenant de l'héparinate de sodium comme anticoagulant, ainsi qu'un liquide de haute densité, et une barrière en gel de polyester qui sépare les deux liquides. Centrifuger l'échantillon à température ambiante dans un rotor à godets balanciers pendant 20 minutes à 1800 × g. Après l'arrêt de la centrifugation, le contenu du tube sera séparé en cinq couches.La couche supérieure jaune clair est constituée du plasma. En dessous, une couche blanchâtre contient les cellules mononucléées du sang périphérique et les plaquettes, qui se trouvent au-dessus de la solution de densité jaune pâle. Une couche de gel polyester de couleur blanche sépare cette dernière des sites granuleux, qui forment une couche grisâtre située au-dessus des globules rouges au fond du tube.À l’aide d’une pipette de deux millilitres, prélevez soigneusement une fraction de la couche plasmatique, en laissant cinq à dix millimètres de plasma au-dessus de l’interface, puis transférez-la dans un tube conique de 15 millilitres. Placez le tube à quatre degrés Celsius pour une utilisation ultérieure en culture. Ensuite, utilisez une pipette de deux millilitres pour récupérer la fraction enrichie en PBMC située à l’interface et transférez-la dans un tube conique de 15 millilitres.Pour laver les PBMC, ajoutez 10 millilitres de PBS et retournez le tube cinq fois. Ensuite, centrifugez le tube pendant cinq minutes à 400 ×g. Répétez les étapes de lavage deux fois. Puis, après avoir réutilisé la palette de cellules dans cinq millilitres de PBS, utilisez un hémocytomètre pour déterminer le nombre de cellules.Généralement, 1,3 × 10⁶ cellules sont récupérées à partir d'un millilitre de sang total. Une fraction de PBMNC contenant 1 × 10⁶ cellules est séparée et conservée sur glace pour l'analyse par cytométrie en flux.Pour amplifier les cellules T gamma delta dans l'échantillon de PBMC, centrifuger les suspensions cellulaires dans des tubes coniques de 15 millilitres pendant cinq minutes à 400 ×g à température ambiante. Après la centrifugation, éliminer les surnageants et resuspendre les cellules dans un milieu de culture cellulaire, supplémenté avec 1000 UI par millilitre d'IL-2 et 5 micromolaire de zolédronate, à une densité de 1 × 10⁶ cellules par millilitre. Le zolédronate inhibe la synthase du pyrophosphate de farnésyle dans les monocytes, entraînant l'accumulation de pyrophosphate d'isopentényl et la transformation des monocytes en cellules présentatrices d'antigènes.Ensuite, prélevez par pipette un millilitre de milieu contenant un fois dix puissance six cellules et déposez-le dans chaque puits d'une plaque de 24 puits. La densité cellulaire doit être de 0,5 fois dix puissance six par centimètre carré. Ainsi, pour des cultures plus grandes, ajustez les quantités en conséquence pour chaque puits d'une plaque de 24 puits.Ajouter soit les 100 microlitres de plasma autologue prélevé précédemment, soit du sérum humain AB en pool ou du FBS. Placer les plaques dans une étuve humide à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone tous les deux à trois jours. Remplacer le milieu par un milieu frais supplémenté en sérum contenant 1000 UI par millilitre d'IL-2 humaine.Lorsque les cellules atteignent une densité de 0,5 à 2 × 10⁶ cellules par millilitre, les repiquer au ratio de 1 à 2 dans de nouveaux puits ou flacons. Observer les cellules pendant plusieurs jours. Ci-dessous, les cellules au jour zéro.Les cellules plus petites sont des lymphocytes. Les cellules plus grandes sont des monocytes. Environ 24 heures plus tard, les monocytes adhèrent au fond de la cavité.Après deux jours, certains lymphocytes s'attachent aux monocytes d'ici trois jours, et les cellules T gamma delta commencent à former des agrégats. Au bout de cinq jours, de grands agrégats cellulaires peuvent être observés. En revanche, aucun agrégat ni aucune agrégation ne sera observé lorsque la croissance des cellules T gamma delta n'est pas adéquate. Lorsque la formation d'agrégats est retardée.Comme indiqué ici, la croissance d'autres types cellulaires, tels que les lymphocytes T alpha bêta CD4 positifs ou CD8 positifs, ou les cellules NK, domine la croissance des lymphocytes T gamma delta. Aux jours 12 à 14, pipetez soigneusement les cellules avec une pipette de 10 millilitres et récoltez-les dans des tubes coniques de 50 millilitres. Les cellules peuvent désormais être analysées par cytométrie en flux afin de déterminer la fréquence, le phénotype et les fonctions des lymphocytes T gamma delta.Pour effectuer une analyse phénotypique de PBMC ou de cellules T gamma delta expansées, commencez par transférer des échantillons de 200 microlitres contenant deux fois 10 à la puissance 5 cellules dans chacun des neuf tubes de tri cellulaire activé par fluorescence. Ajoutez deux millilitres de PBS froid et centrifugez pendant cinq minutes à 400 × g, puis resuspendez les culots dans 50 microlitres. Ajoutez cinq microlitres de chacun des anticorps requis aux échantillons.Incuber les échantillons sur de la glace à l'abri de la lumière pendant 20 minutes. Après l'incubation, ajouter deux millilitres de tampon fax à chaque échantillon, puis vortexer et centrifuger les échantillons pendant cinq minutes à 400 ×g à quatre degrés Celsius. Après la centrifugation, décanté soigneusement le surnageant, resuspendre les cellules dans 300 microlitres de tampon fax et vortexer.Ensuite, analyser les échantillons sur un cytomètre en flux pour évaluer la fonction des cellules T gamma delta. Leur capacité à produire de l'interféron gamma est analysée par coloration intracellulaire de l'interféron gamma. Résuspender les cellules T gamma delta à deux fois dix puissance six cellules par millilitre dans du RPMI 10 contenant du feldén A à 20 microgrammes par millilitre.Felden A inhibe la sécrétion d'interféron gamma, entraînant l'accumulation d'interféron gamma dans la cellule. Ensuite, transférez 100 microlitres de suspension de lymphocytes T gamma delta dans chaque puits d'une plaque de 96 puits contenant uniquement 100 microlitres de RPMI 10, ou 100 microlitres de RPMI 10 avec 20 nanogrammes par millilitre de four. Ball 12 ate 13 acétate plus 2 microgrammes par millilitre d'ionomycine ou de cellules Z duddy.Mélanger en pipettant plusieurs fois vers le haut et vers le bas. Incuber pendant quatre heures dans une étuve à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Ensuite, centrifuger la plaque pendant cinq minutes à 400 ×g et 4 degrés Celsius après resus, en resuspendant les culots dans 200 microlitres de PBS froid.Transférez les échantillons dans des tubes fax. Ajoutez ensuite quatre millilitres de PBS froid et centrifugez les tubes pendant cinq minutes à 400 ×g à quatre degrés Celsius. Après la centrifugation, resuspendez les culots dans 50 microlitres de tampon fax avec cinq microlitres.Incuber 2,5&nbsp;microlitres d'anticorps monoclonaux anti-CD3 conjugué au PE SCI5 et un volume équivalent d'anticorps anti-TCRVγ9 conjugué au FE, à l'abri de la lumière pendant 15&nbsp;minutes à température ambiante. Après l'incubation, ajouter 100&nbsp;microlitres du réactif intra prep un et incuber pendant 15&nbsp;minutes. À température ambiante, ajouter 4&nbsp;mililitres de PBS dans chaque tube et centrifuger pendant 5&nbsp;minutes à 400&nbsp;×&nbsp;g à température ambiante. Après la centrifugation, resuspendre le culot dans 100&nbsp;microlitres du réactif intra prep deux et incuber pendant 5&nbsp;minutes.Ajouter, à température ambiante, cinq microlitres d'anticorps monoclonal anti-interféron gamma conjugué à la PE dans le tube à essai. Incuber à l'abri de la lumière pendant 15 minutes. Ajouter, à température ambiante, quatre millilitres de PBS dans chaque tube et centrifuger pendant cinq minutes à 400 × g. À température ambiante, éliminer le surnageant par aspiration et resuspendre le culot cellulaire.Dans 0,5 millilitre de tampon fax. Analyser les cellules par cytométrie en flux en utilisant une fenêtre pour les cellules positives pour CD trois et TCR v gamma neuf, puis examiner l'expression de l'interféron gamma. Le phénotype typique de surface des cellules T gamma delta est illustré comme indiqué ici.Les cellules T gamma delta ont été identifiées par leur expression de CD trois et de TCRV gamma neuf au jour zéro. Le pourcentage de cellules T gamma delta CD trois positif, TCRV gamma neuf positif parmi les PBMC était de 1,6 %. Les populations dominantes de cellules T gamma delta étaient de phénotype naïf CD 27 positif, CD 45 RA positif ou de phénotype mémoire central CD 27 positif, CD 45 RA négatif. L'expression de CD 27 et de CD 45 RA est utilisée pour déterminer leur phénotype naïf ou mémoire.CD 27 positif. CD 45. RA positif indique un état naïf.CD 27 positif. CD 45 RA négatif correspond à une mémoire centrale CD 27 négatif. CD 45.RA négatif correspond à la mémoire effectrice. CD 27 négatif. CD 45.Le phénotype positif pour RA est différencié de manière terminale. L'état d'activation des cellules a été analysé par NK G 2D ou CD 69, comme indiqué ici. Les cellules T gamma delta expriment NK G 2D, mais n'expriment pas CD 69.Après 14 jours de culture, la fréquence des cellules T gamma delta a augmenté pour atteindre plus de 93,8 % des cellules cultivées. Dans les cultures réussies de cellules T gamma delta, celles-ci présentaient un phénotype de mémoire effecteur CD27 négatif et CD45RA négatif. Les cellules T gamma delta cultivées ont surexprimé les marqueurs NKp44 et CD69.La coloration intracellulaire de l'interféron gamma a démontré que les cellules T gamma delta produisaient de l'interféron gamma en réponse au traitement par PMA CIN ou aux cellules Z dwy accumulant l'IPP. Après traitement au zolédronate, 97 % et 19,6 % des cellules T gamma delta ont produit de l'interféron gamma en réponse à la stimulation par PMA CIN et par cellules Z ddy, respectivement. Ces résultats indiquent que le zolédronate peut stimuler efficacement et amplifier des cellules T gamma delta fonctionnelles.La cinétique de la culture des lymphocytes T gamma delta amplifiés par le zolédronate et l'IL-2 montre une augmentation exponentielle du nombre absolu de cellules cultivées jusqu'aux jours 12 à 14. L'enrichissement en lymphocytes T gamma delta a été obtenu relativement tôt. Dès le jour 7, près de 80 % des cellules cultivées étaient des lymphocytes T gamma delta. Le nombre absolu de lymphocytes T gamma delta aux points temporels indiqués démontre qu'environ 2,2 × 10⁸ cellules T gamma delta peuvent être obtenues à partir de 1 × 10⁶ PPMC contenant 1,6 × 10⁴ cellules T gamma delta après leur développement.Cette technique ouvre la voie aux chercheurs dans le domaine de l'immunothérapie du cancer pour explorer les applications cliniques dans de nombreux types de cancer. Cette méthode de culture a été utilisée dans des essais cliniques de phase un, évaluant la sécurité et la faisabilité de la thérapie par transfert de lymphocytes T gamma delta expansés à partir de donneurs chez des patients atteints de cancer.

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