Name: Isolement des cellules CD133 + Foie souches pour lexpansion clonale (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 6 s
Description: Découvrez l'isolement des cellules souches hépatiques CD133+ à partir de foie murin pour l'expansion clonale. Cette méthode combine digestion tissulaire, cytométrie en flux et culture cellulaire pour étudier la régénération hépatique.

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Dr Rountree reconnaît le soutien actuel du Réseau Enfants-Santé, Institut National de la Santé, et de K08DK080928 R03DK088013, et la Société américaine du cancer Research Scholar Award, MGO-11651. Dr Rountree reconnaît que cette procédure a été initialement développé et affiné tout financé par le Programme de développement scientifique en pédiatrie (NICHD Grant Award K12-HD00850).

<ol><li>Rountree, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CD133-expressing+murine+liver+oval+cell+population+with+bilineage+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">A CD133-expressing murine liver oval cell population with bilineage potential.</a> Stem Cells. 25, 2419-2429 (2007).</li>
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<li>Rountree, C. B., Ding, W., He, L., Stiles, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+of+CD133-expressing+liver+cancer+stem+cells+in+liver-specific+phosphatase+and+tensin+homolog+deleted+on+chromosome+10-deleted+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Expansion of CD133-expressing liver cancer stem cells in liver-specific phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10-deleted mice.</a> Stem Cells. 27, 290-299 (2009).</li>
<li>Rountree, C. B., Senadheera, S., Mato, J. M., Crooks, G. M., Lu, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+of+liver+cancer+stem+cells+during+aging+in+methionine+adenosyltransferase+1A-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Expansion of liver cancer stem cells during aging in methionine adenosyltransferase 1A-deficient mice.</a> Hepatology. 47, 1288-1297 (2008).</li>
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<li>Fausto, N., Campbell, J. S., Riehle, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Liver regeneration.</a> Hepatology. 43, 45-53 (2006).</li>
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<li>Rountree, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow+fails+to+differentiate+into+liver+epithelium+during+murine+development+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Bone marrow fails to differentiate into liver epithelium during murine development and regeneration.</a> Hepatology. 45, 1250-1260 (2007).</li>
<li>Shimano, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+oval+cells+have+the+side+population+phenotype+defined+by+expression+of+ATP-binding+cassette+transporter+ABCG2%2FBCRP1%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Hepatic oval cells have the side population phenotype defined by expression of ATP-binding cassette transporter ABCG2/BCRP1.</a> Am J Pathol. 163, 3-9 (2003).</li>
<li>Suzuki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+isolation+and+clonal+identification+of+self-renewing+bipotent+hepatic+progenitor+cells+in+adult+mouse+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric isolation and clonal identification of self-renewing bipotent hepatic progenitor cells in adult mouse liver.</a> Hepatology. , (2008).</li>
<li>Suzuki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+identification+and+characterization+of+self-renewing+pluripotent+stem+cells+in+the+developing+liver%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Clonal identification and characterization of self-renewing pluripotent stem cells in the developing liver.</a> J Cell Biol. 156, 173-184 (2002).</li>
<li>Yamashita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EpCAM-positive+hepatocellular+carcinoma+cells+are+tumor-initiating+cells+with+stem%2Fprogenitor+cell+features%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">EpCAM-positive hepatocellular carcinoma cells are tumor-initiating cells with stem/progenitor cell features.</a> Gastroenterology. 136, 1012-1024 (2009).</li>
<li>Yamashita, T., Budhu, A., Forgues, M., Wang, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+hepatic+stem+cell+marker+EpCAM+by+Wnt-beta-catenin+signaling+in+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Activation of hepatic stem cell marker EpCAM by Wnt-beta-catenin signaling in hepatocellular carcinoma.</a> Cancer Res. 67, 10831-10839 (2007).</li>
<li>Furuyama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+cell+supply+from+a+Sox9-expressing+progenitor+zone+in+adult+liver%2C+exocrine+pancreas+and+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Continuous cell supply from a Sox9-expressing progenitor zone in adult liver, exocrine pancreas and intestine.</a> Nat Genet. 43, 34-41 (2011).</li>
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<li>Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+restriction+of+human+hepatic+stem+cells+to+mature+fates+is+made+efficient+by+tissue-specific+biomatrix+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Lineage restriction of human hepatic stem cells to mature fates is made efficient by tissue-specific biomatrix scaffolds.</a> Hepatology. 53, 293-305 (2011).</li>
<li>Galicia, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+of+hepatic+tumor+progenitor+cells+in+Pten-null+mice+requires+liver+injury+and+is+reversed+by+loss+of+AKT2%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Expansion of hepatic tumor progenitor cells in Pten-null mice requires liver injury and is reversed by loss of AKT2.</a> Gastroenterology. 139, 2170-2182 (2010).</li>
<li>Ding, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial-to-mesenchymal+transition+of+murine+liver+tumor+cells+promotes+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Epithelial-to-mesenchymal transition of murine liver tumor cells promotes invasion.</a> Hepatology. 52, 945-953 (2010).</li>
</ol>

Dr Rountree reçoit un soutien de recherche de Pharmacie de Bayer. Drs. Ding et Crooks et Mme Dang et Mme VanKirk n&#39;ont aucune divulgation à signaler.

Contrairement au système hématopoïétique, dans lequel les cellules souches hématopoïétiques sont responsables de maintenir un système de différenciation cellulaire qui replacesnormal physiologiques turn-over des leucocytes, des globules rouges et de plaquettes, de cellules souches du foie, ou un adulte les cellules progénitrices du foie, ne participent pas au foie normal homéostasie 5,6. Après une lésion hépatique aiguë ou une hépatectomie partielle, les hépatocytes, l&#39;épithélium du foie différenciées, subissent plusieurs cycles de multiplication pour remplacer la masse du foie a perdu 5,6. Seulement pendant des blessures chroniques sont des cellules souches du foie observées à proliférer. 1,5 -11 Ces adultes, les cellules souches d&#39;organes spécifiques sont proposées pour se différencier en hépatocytes et deux cholangiocytes. 1,5-8 intéressant, la grande majorité des cancers du foie se développe sur fond de blessures chroniques, et donc les cellules souches du foie sont également émis l&#39;hypothèse d&#39;être les précurseurs d&#39;un sous-ensemble de cancer du foie. 2-4,12-17 Un des défis majeurs pour enrayer le travail des cellules dans le foie est l&#39;isolement des populations de cellules rares pour l&#39;analyse fonctionnelle. Par exemple, la grande majorité des cellules dans le foie sont les hépatocytes, qui sont nettement plus grandes que cholangiocytes et autres petits cellules non parenchymateuses. En brisant le foie entier dans des compartiments cellulaires (hépatocytes grands - fraction du parenchyme et des cellules plus petites - non parenchymateuses fraction), et encore la sélection des cellules CD45 négatives (non-cellules hématopoïétiques), nous sommes capables d&#39;enrichir la population de départ de cellules souches par plus de 600 fois. 1,18-21 Fait à noter, nous sommes en aucun cas ce qui indique que la population CD133 + est un 100% de la population de cellules souches pures, mais représente clairement une population hétérogène de cellules, avec la lignée différente et le potentiel de repopulation. Une des principales limites de ce champ est la définition des cellules souches et cellules progénitrices. Nous utilisons les &quot;cellules souches&quot; terme plus largement dans ce travail, mais dans une définition stricte, CD133 + non parenchymateuses cellules représentent une population progénitrices bi-lignée. Étant donné l&#39;état de cellules souches progénitrices et des recherches actuelles dans le foie, ce rapport fournit un point de départ pour les enquêteurs qui sont intéressés dans ce domaine. Comme de nouveaux marqueurs émergent, tels que EpCAM, 22,23 ou des facteurs de transcription, tels que Sox9, 24 ils peuvent être incorporés. Par exemple, nous avons trouvé un taux assez élevé de chevauchement entre les cellules EpCAM + et CD133 + cellules. Dans ce rapport, nous détaillons un processus d&#39;isolement de cellules souches du foie murin normale ainsi que les modèles des lésions hépatiques chroniques, qui démontrent une prolifération accrue des cellules du foie souches. Cette méthode a des avantages évidents sur immunohistochimie standard de foie congelé ou fixé au formol que des études fonctionnelles utilisant des cellules vivantes peut être effectuée après l&#39;isolement. 1,3,4 L&#39;objectif spécifique de ce processus consiste à isoler une population relativement pure de cellules souches du foie qui peut être élargi par clonage in vitro. La principale limitation de cette procédure est que la majorité des cellules isolées ne sera pas viable après la cytométrie de flux (voir la section Dépannage). Ceci est le résultat des heures requises pour préparer les cellules, et les nombreuses procédures nécessaires pour affiner la population avant l&#39;isolement. Si le foie est digéré en suspension seule cellule d&#39;analyse FACS immédiat, la différence de taille entre les hépatocytes et d&#39;autres cellules non parenchymateuses se rendre effective la création porte FACS impossible. Si le foie non parenchymateuses cellules sont utilisées, sans élimination des cellules hématopoïétiques, il ya un risque qu&#39;un nombre significatif de cellules CD133 + peut être d&#39;origine hématopoïétique peut contaminer la fraction. Par ailleurs, en traitant les cellules à travers le filtre Miltenyi, seulement des cellules individuelles et des grappes très petit nombre de cellules sont collectées. Cela garantit que l&#39;échantillon ne sera pas obstruer l&#39;aiguille d&#39;admission par FACS. Alternatives pour cette procédure incluent la modification de tout marqueur de surface cellulaire de remplacement, comme CD49f, EpCAM, ou une combinaison de marqueurs, tels que CD133 + + EpCAM Un deuxième rapport publié utilise un gradient de densité afin d&#39;isoler les cellules souches du foie d&#39;une fraction non parenchymateuses. Cette procédure nécessite une centrifugeuse ultra-(8000 xg), ajoute beaucoup de temps à la procédure, et dans notre expérience, a réduit significativement le rendement de pré-FACS cellulaires et post-FACS viabilité. 8 Les expériences futures incluent une gamme plus large de l&#39;analyse d&#39;expression génique, y compris les gènes du foie fœtal, tels que HNF3, HNF4α, et plus αfp.In, analyse Western blot et immunocytochimie des protéines exprimées peut être utilisée pour confirmer les résultats de RT-PCR de cellules en culture. Une question à noter est que les travaux récents identifié CD133 expression sur les cellules étoilées du foie. 25 Nous avons maintenant un dépistage systématique de nos échantillons pour les marqueurs des cellules étoilées (voir section Dépannage), et n&#39;ont pas d&#39;identitéentified contamination importante dans nos fractions. Ceci peut être lié à différentes techniques de la digestion du foie et de l&#39;isolement cellulaire. 2,3,26 Basé sur le fait que la majorité des cellules ne sera pas viable immédiatement après l&#39;isolement FACS, nous recommandons que les cellules soient plaqués, soit en vrac CD133 + des cellules ou des cellules isolées, avant de l&#39;utiliser chez les animaux. 5-7 jours in vitro de manière significative à améliorer les résultats de l&#39;analyse de la tumeur. En outre, étant donné les rigueurs de l&#39;isolement cellulaire unique, cela ne devrait être effectuée une fois les colonies peuvent être étendues à partir CD133 + en vrac des cellules isolées. Une discussion plus approfondie des conditions de culture différentes et des protéines d&#39;échafaudage qui peuvent être utilisées pour endiguer le foie et les cellules progénitrices de la culture a été bien caractérisé par Lola Reid. Ce travail offre des conditions alternatives et des modifications qui les enquêteurs peuvent intégrer dans leur programme de recherche une fois que les techniques d&#39;isolation de base sont maîtrisées. 27,28 Dr Travaux de Reid fournit également une analyse plus détaillée de la biologie et de la lignée de maturation entre les cellules souches et de progéniteurs hépatiques commis. En termes de l&#39;analyse des tumeurs in vivo, nous avons eu du succès en utilisant cellules fraîchement isolées et des cellules de clonage élargi CD133 + cellules in vitro, utilisant principalement 1x10 6 cellules. Nous avons concentré les souches génétiques ontwo de lésion hépatique chronique, l&#39;MAT1a - / - et PTEN spécifique du foie - / - souris, et nous avons utilisé deux souris nude et souris de type sauvage comme hôtes pour la croissance tumorale. Dans notre expérience, les cellules CD133 + tige du foie ne forment des tumeurs si elles sont isolées à partir des modèles des lésions hépatiques importantes qui sont pré-malignes. Notez que les tumeurs formées à partir des cellules CD133 + ont en général un carcinome hépatocellulaire et des fonctionnalités à la fois le cholangiocarcinome, suggérant une cellule souche ou d&#39;origine de cellules progénitrices de la tumeur. 2-4,29 Le travail de suivi après les tumeurs sont documentés comporte en standard d&#39;analyse pathologique des tissus tumoraux (coloration H &amp; E) et la coloration immunohistochimique. En outre, les tumeurs peuvent être hachée et digérées pour l&#39;analyse de FACS ou re-culture. 2-4,30 En conclusion, nous avons une procédure détaillée pour l&#39;isolement, l&#39;expansion et la caractérisation de base des cellules CD133 + souches hépatiques et CD133 + cellules souches cancéreuses. Dépannage: CD45 contamination: Pour l&#39;étape 3, s&#39;il ya contamination du CD45 des cellules +, qui peut être évaluée par l&#39;ajout d&#39;un Ab CD45-FITC avant analyse FACS et l&#39;isolement, vérifiez que l&#39;anticorps CD45 microbille n&#39;est pas expiré et que le filtrat a été recueilli seulement pendant que la filtre a été dans le support magnétique. Toute filtrat recueilli alors que le filtre n&#39;est pas dans le support magnétique contient des cellules CD45 +. Faible nombre de cellules: Pour le foie indemne, le nombre total de cellules CD133 + non parenchymateuses isolées peut être inférieur à 10 000. Ces cellules sont rares dans le foie au repos. Pour un modèle de blessures chroniques, comme le régime alimentaire CDD de 0,1%, le nombre va augmenter fortement à 100 000 cellules. Si le nombre total de cellules est nettement inférieur à ces chiffres, une question à considérer est la coloration FACS Ab. Vérifiez que le CD133 Ab n&#39;est pas expiré, que la coloration pauvres se traduira par un faible rendement. Aussi, nous vous recommandons d&#39;effectuer une analyse FACS de foie non parenchymateuses cellules pour déterminer la population relative avant l&#39;isolement FACS tentant. La viabilité des cellules après la Basse FACS: Un des problèmes de viabilité peut être liée à la façon dont les cellules sont traitées et sur quelle période. Idéalement, la procédure d&#39;isolement cellule entière, les étapes 1-4, doit être menée sans délais entre les étapes et terminé dans la même journée. Tout retard important entre les étapes 1-4 de réduire considérablement la viabilité cellulaire. Une deuxième question liée à la viabilité des cellules peut être liée à la pression gaine utilisée pour l&#39;isolation par FACS. Nous vous recommandons d&#39;utiliser une pression inférieure de la gaine. Enfin, une fois les cellules sont isolées, elles doivent être immédiatement plaquée, comme tout système de stockage important sur la glace après le tri permettra également de réduire la viabilité. CD133 + non parenchymateuses hétérogénéité: Des rapports récents indiquent que les cellules étoilées du foie peuvent aussi avoir CD133 expression et avoir une certaine plasticité. 25 Par conséquent, en plus de vérifier la puissance bi-gènes avec l&#39;albumine et de Krt19, une vérification supplémentaire peut inclure les gènes associés avec des cellules étoilées, comme fibrillaire gliale acide en protéines cellules étoilées de repos et l&#39;actine musculaire lisse alpha-et la desmine dans les cellules étoilées activées. 3,4,26 En outre, la population CD133 + représente une population plus large progénitrices. L&#39;ajout d&#39;un deuxième marqueur, comme EpCAM, peut aider à affiner davantage la population, et l&#39;hétérogénéité limite.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du réactif </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commentaires (optionnel) </th></tr><tr><td> DMEM: F12 </td><td> Invitrogen </td><td> 10565-018 </td><td> Avec le rouge de phénol </td></tr><tr><td> CD45 microbilles </td><td> Miltenyi </td><td> 130-052-301 </td><td></td></tr><tr><td> Facteur de croissance des hépatocytes </td><td> Sigma </td><td> H1404 </td><td></td></tr><tr><td> Facteur de croissance épidermique </td><td> Sigma </td><td> E4127 </td><td></td></tr><tr><td> DNase </td><td> Sigma </td><td> DN25 </td><td> 1 gramme </td></tr><tr><td> Collagénase D </td><td> Roche </td><td> 1088874 </td><td></td></tr><tr><td> Pronase </td><td> Roche </td><td> 0165921 </td><td></td></tr><tr><td> 70 microns mailles </td><td> Fisher </td><td> 352350 </td><td></td></tr><tr><td> Omniscript RT </td><td> Quaigen </td><td> 205111 </td><td> 50 réactions </td></tr><tr><td> HotStarTaq </td><td> Quaigen </td><td> 203203 </td><td></td></tr><tr><td> Miltenyi LD colonne </td><td> Miltenyi </td><td> 130-042-901 </td><td></td></tr><tr><td> CD133-PE FACS Ab </td><td> eBioscience </td><td> 12-1331-82 </td><td></td></tr><tr><td> Plaques laminine revêtement </td><td> BD </td><td> 354410 </td><td> 96 puits </td></tr><tr><td> Trypsine 0,05% EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> 25300-354 </td><td> 100 ml </td></tr><tr><td> Kit RNeasy Micro </td><td> Quaigen </td><td> 74004 </td><td> 50 colonnes pour les 5x10 5 cellules ou moins </td></tr><tr><td> Pharm Lyse </td><td> BD </td><td> 555899 </td><td> Concentration 10X </td></tr></tbody></table>

isolement des cellules cd133 + foie souches pour l&#39;expansion clonale

Isolation of CD133+ Liver Stem Cells for Clonal Expansion

Cellules souches du foie, ou des cellules ovales, prolifèrent au cours des lésions hépatiques chroniques, et sont proposés à se différencier en hépatocytes et deux cholangiocytes. En outre, les cellules souches du foie sont suppose être les précurseurs d&#39;un sous-ensemble de cancer du foie, le carcinome hépatocellulaire. Un des défis principaux pour enrayer le travail des cellules dans tous les organes solides comme le foie est l&#39;isolement d&#39;une population rare de cellules pour une analyse détaillée. Par exemple, la grande majorité des cellules dans le foie sont les hépatocytes (fraction du parenchyme), qui sont nettement plus grandes que les cellules non parenchymateuses. En enrichissant les compartiments cellulaires spécifiques du foie (c.-parenchymateuses et non parenchymateuses fractions), et en sélectionnant les cellules pour CD45 négatives, nous sommes en mesure d&#39;enrichir la population de départ des cellules souches par plus de 600 fold.The proceduresdetailed dans ce rapport permettent de une population relativement rare de cellules d&#39;un organe solide à trier efficacement. Ce processus peut être utilisé pour les cellules souches du foie murin isolateliver normale ainsi que les modèles des lésions hépatiques chroniques, qui démontrent la prolifération accrue des cellules du foie souches. Cette méthode a des avantages évidents sur immunohistochimie standard de foie congelé ou fixé au formol que des études fonctionnelles utilisant des cellules vivantes peut être effectuée après la première co-localisation des expériences. Pour accomplir la procédure décrite dans ce rapport, une relation de travail avec une recherche basée cytométrie de flux de base est fortement encouragée que les détails de l&#39;isolement FACS sont fortement tributaires des instruments spécialisés et d&#39;une solide connaissance pratique de base cytométrie en flux des procédures. L&#39;objectif spécifique de ce processus consiste à isoler une population de cellules souches du foie qui peut être élargi par clonage in vitro.

Nous décrivons ici l&#39;isolement des cellules souches CD133 exprimer foie et les cellules souches du cancer du foie murin ensemble, un processus qui nécessite la digestion des tissus, l&#39;enrichissement des cellules, et l&#39;isolement de cytométrie en flux. Nous incluent des méthodes pour l&#39;isolement cellulaire de pointe unique et l&#39;expansion clonale.

Isolement des cellules CD133 + Foie souches pour l&#39;expansion clonale

Les cellules souches hépatiques, ou cellules ovales, prolifèrent lors d'une lésion hépatique chronique, et seraient capables de se différencier en hépatocytes ainsi qu'en cholangiocytes. Dans...

Ce vidéo montre une procédure d'isolement des cellules souches hépatiques pour étudier l'expansion clonale à l'aide de l'expression membranaire du marqueur CD133 après une lésion hépatique chronique. Tout d'abord, le foie est prélevé chez une souris présentant une lésion hépatique chronique, puis digéré afin d'obtenir une suspension monocellulaire. Un tampon de lyse des globules rouges est ensuite ajouté pour éliminer les érythrocytes, et la solution est appliquée sur une colonne magnétique contenant un anticorps anti-CD45 afin de retirer les leucocytes CD45.Les cellules appauvries en CD45 sont ensuite triées pour enrichir les cellules souches hépatiques positives pour le CD133. Les cellules souches hépatiques positives pour le CD133 finalement isolées sont cultivées et amplifiées. Une analyse in vitro de l'expression des gènes et des protéines démontre que les cellules souches positives pour le CD133 isolées sont capables de se différencier en hépatocytes et en ostéocytes.Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que la colocalisation de marqueurs à l'aide de techniques d'immunohistochimie, réside dans la possibilité d'isoler des cellules individuelles afin d'obtenir une expansion clonale et d'effectuer une analyse fonctionnelle. Afin de confirmer les phénotypes de cellules souches et de cellules progénitrices, la démonstration de la technique sera réalisée par moi-même et He Dang, un étudiant diplômé de mon laboratoire. Préparez tous les tampons dans le milieu 24 heures à l'avance et conservez-les à quatre degrés Celsius jusqu'à leur utilisation.Les milieux, les instruments, les filtres et les tubes doivent être stériles et manipulés selon une technique stérile. Pour réduire le risque de contamination, essuyez la zone abdominale d'une souris euthanasiée avec de l'éthanol à 70 %. À l'aide d'instruments stériles, ouvrez la cavité abdominale et exposez le foie sur le bloc.Retirer la vésicule biliaire du foie explanté, puis transférer l'ensemble du foie dans une hotte à flux laminaire, dans une boîte stérile fermée. Utiliser une lame de rasoir stérile pour hacher le foie à l'aide de plusieurs coupes horizontales et verticales combinées. Pendant une minute, diviser le foie haché en quatre parties et placer chaque partie dans un tube de 15 millilitres contenant 10 millilitres de solution d'enzymes pour la digestion. Placer ensuite les tubes dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant 45 minutes, sur un agitateur réglé à un à deux cycles par seconde.Après l'incubation, essuyez les tubes avec de l'éthanol à 70 %. Ensuite, sous une hotte à flux laminaire, pipetez la pulpe hépatique digérée à travers un filtre en maille de 70 microns et récupérez l'écoulement dans une boîte stérile afin d'éliminer la fraction parenchymateuse contenant les hépatocytes plus gros. Rincez le filtre avec deux aliquots de deux millilitres de milieu D-M-E-M-F 12 stérile supplémenté.Utilisez l'extrémité en caoutchouc du piston d'une seringue pour écraser la pulpe digérée à travers le filtre. Répétez ce processus cinq fois afin d'obtenir un volume total d'environ 20 millilitres. Répartissez le filtrat en deux tubes de 15 millilitres égaux, puis centrifugez à 50 ×g pendant une minute à quatre degrés Celsius.Après la centrifugation, transférez le SUP natin dans un tube étiqueté snat numéro un et jetez le parenchyme palt. Ensuite, pour recueillir la fraction non parenchymateuse, qui contient les cellules souches et progénitrices, centrifugez le SUP natin numéro un à 50 × g pendant une minute.Transférez le surnageant dans un tube étiqueté « surnageant, numéro deux », puis jetez à nouveau le culot. Ensuite, centrifugez le surnageant numéro deux à 50 ×g pendant une minute.Après la centrifugation, transférez le surnageant dans un tube étiqueté surnageant numéro trois, et jetez le culot. Enfin, centrifugez le surnageant final numéro trois à 180 ×g pendant huit minutes afin d'obtenir la fraction non parenchymateuse. Après la centrifugation, jetez le surnageant et passez immédiatement à l'étape suivante du protocole, au cours de laquelle les globules rouges et le culot sont lysés. Le tampon de lyse des globules rouges et le tampon Milli-Tene utilisés pour cette partie de la procédure doivent avoir été préparés la veille et conservés à quatre degrés Celsius conformément aux instructions du document écrit joint.Travailler dans une hotte à flux laminaire avec les cellules et les solutions sur de la glace. Resuspendre le culot non parenchymateux obtenu à l'étape précédente dans un millilitre de tampon de lyse des érythrocytes dilué au 1x, puis transférer dans un tube de cinq millilitres. Boucher le tube et vortexer doucement pendant cinq secondes.Incuber pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius. Protéger de la lumière une fois les 15 minutes écoulées. Centrifuger le tube à 200 × g pendant cinq minutes, puis éliminer le surnageant contenant les globules rouges lysés et les resus.Suspendre le culot dans un millilitre de tampon froid stérile prélevé sur de la glace. Centrifuger à 200 ×g pendant cinq minutes. Après la centrifugation, éliminer le surnageant et resuspendre le culot dans un millilitre de tampon froid stérile prélevé sur de la glace.Buffer Milton e. Ensuite, retirez 10 microlitres de cette suspension cellulaire et ajoutez 10 microlitres de Trypan bleu. Comptez les cellules non parenchymateuses à l’aide d’un hémocytomètre afin d’effectuer l’épuisement des cellules hématopoïétiques CD45 à partir de la fraction non parenchymateuse.Commencez dans la hotte à flux laminaire en ajustant la concentration des cellules à 10⁷ à 10⁸ cellules totales dans 100 µL de tampon melty. Veillez à maintenir les cellules et les tampons au froid pendant toute la procédure.Ensuite, ajoutez 20 microlitres de mil, tout anticorps marqué par des microbilles CD45 par 10 millions de cellules et incubez à quatre degrés Celsius pendant 15 minutes. Après l'incubation, ajoutez deux millilitres supplémentaires de mil, tout tampon et centrifugez à 200 × g pendant cinq minutes. Après la centrifugation, retirez le surnageant et resuspendez jusqu'à 10⁸ cellules dans un millilitre.Mil, tout tampon dans une hotte à flux laminaire, placez un Mil, toute colonne magnétique LD dans un support magnétique. Placez un tube stérile de cinq millilitres sous le filtre pour recueillir le filtrat. Ensuite, chargez deux millilitres.Faites fondre un tampon quelconque pour effectuer un prélavage par filtration. Une fois le lavage terminé, chargez les cellules sur la colonne. Lorsque la suspension cellulaire est entièrement dans la colonne, ajoutez un millilitre de tampon fondu pour laver la colonne ; répétez ce lavage deux fois supplémentaires.Ne pas utiliser le piston fourni avec la colonne pour accélérer la filtration. Une fois tous les lavages effectués, centrifuger le filtrat recueilli des cellules non parenchymateuses appauvries en CD45 à 200 × g pendant cinq minutes. Jeter la colonne contenant les cellules positives pour CD45 retenues.Ensuite, la cytométrie en flux est effectuée afin d'isoler les cellules positives pour CD133. Resuspendre les cellules dans un tampon Milt, à raison de 10⁷ cellules par aliquot de 100 microlitres. Répartir 100 microlitres dans trois tubes. Dans le premier tube, ajouter 2 microlitres d'anticorps conjugué à la PE anti-CD133. Dans le deuxième tube, ajouter un anticorps IgG conjugué à la PE comme témoin.Le troisième tube de cellules servira de témoin non marqué, incubé à quatre degrés Celsius pendant 15 minutes à l'obscurité. Après l'incubation, resuspendre dans deux millilitres de tampon de marquage, centrifuger à 200 ×g pendant cinq minutes. Éliminer le surnageant et resuspendre le culot dans un millilitre de tampon Milton e. Ensuite, sur le cytomètre en flux, utiliser les cellules non marquées et les cellules marquées au IGPE pour ajuster les paramètres de tri afin d'optimiser le positionnement de la porte sur la population de cellules positives pour CD133.Notre FICO ERYN ou RPE peut généralement être utilisé avec tout cytomètre en flux disposant d'un laser émettant à 488 nanomètres. Enfin, isoler la population de cellules positives pour CD 1 33 à l'aide d'un tri positif pour CD 1 33 et recueillir les cellules dans un milieu pour cellules ovoïdes stérile filtré. Les cellules peuvent désormais être mises en culture, une isolation clonale peut être réalisée, suivie d'une PCR en temps réel pour évaluer le statut potentiel de CD 1 33.Des cellules souches hépatiques positives ont été isolées à partir de souris de type sauvage et de souris présentant un gène MAT1A invalidé, comme décrit dans cette vidéo et illustré ici. Les cellules positives pour CD133 représentent 0,4 % de la fraction non parenchymateuse fortement enrichie, appauvrie en CD45, provenant du foie non lésé de souris de type sauvage. Dans le modèle d'invalidation génétique MAT1A −/−, qui reproduit une lésion hépatique chronique, la population positive pour CD133 s'élargit d'un facteur dix ou plus dans cette même fraction fortement enrichie.Après le tri, les cellules ont été mises en culture et les clones ont été agrandis. Ci-dessous sont présentées des images en contraste de phase de quatre colonies issues de cellules individuelles positives pour CD133, développées sur des plaques de 96 puits revêtues de laminine. Ces cellules sont observées sept jours après leur isolement et montrent des colonies petites et compactes de cellules épithéliales au jour sept, époque à laquelle les colonies comprennent environ 25 cellules.Les ARN ont été isolés à partir des cellules et l'expression génique du marqueur du site cholangiocitaire CK 19 a été analysée, comme on peut le voir dans ces expériences de RT-PCR. L'expression génique montre l'expression de l'albumine, marqueur des hépatocytes, et du CK 19, marqueur cholangiocitaire, confirmant le potentiel des cellules positives pour CD133 plusieurs semaines après l'isolement initial à partir d'une seule cellule positive pour CD133 et leur expansion in vitro. Un million de cellules provenant du modèle mat1, A--, sont injectées par voie sous-cutanée dans des souris nues immunodéficientes. Les flèches indiquent les tumeurs en cours de développement quatre semaines après l'injection des cellules.Les cellules CD133 positives provenant d'une lésion hépatique chronique induite par des toxines, comme le CCL4 ou un régime alimentaire contenant 0,1 % de DDC, ne forment pas de tumeurs. La formation de tumeurs in vivo est utilisée pour identifier le potentiel malin ou le phénotype de cellule souche cancéreuse au sein de la population de cellules souches. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en huit heures si elle est correctement exécutée.Après avoir suivi cette procédure, l'ajout de marqueurs de faits supplémentaires, tels qu'EPAM ou d'autres faits, est possible. Des techniques telles que le flux de population latérale peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme l'affinement des marqueurs de surface des populations de cellules progénitrices hépatiques. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'isoler les cellules souches et progénitrices hépatiques à l'aide de la cytométrie en flux.N'oubliez pas que le travail avec des tissus animaux peut présenter des risques, et que des précautions telles que le port de gants et l'application de techniques de laboratoire appropriées doivent toujours être prises lors de la réalisation de cette procédure.

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