Name: Lénucléation des yeux de souris à distance pour le phénotypage à haut débit (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 30 s
Description: Apprenez l'énucléation des yeux de souris pour le phénotypage à haut débit en neurosciences. Cette technique permet la fixation tissulaire précise et améliore les résultats des études phénotypiques.

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Research to Prevent Blindness; Bartly J. Mondino MD, directeur de l&#39;Institut Jules Stein Eye, UCLA, et Ramiro Ramirez-Solis, Jacqui blanc, et Jeanne Estabel à l&#39;Institut Sanger, Wellcome Trust Genome Campus. Cette recherche est conforme à la Déclaration ARVO pour l&#39;utilisation des animaux en ophtalmologie et de la recherche visuelle.

1. Dissection Blunt: énucléation de l'œil de la souris dans les échantillons non fixés <ol><li> Séparez les paupières pour améliorer la visibilité et l'accès au globe postérieure (œil) de surface. </li><li> Placez un pansement pince courbée derrière (sous) le monde dans l'orbite (orbite de l'œil). Le Mahajan Sharptip pansement pince est un instrument de mesure avec bouts pointus pour faciliter cette étape (voir matériels et réactifs de table). </li><li> Fermez la pince et saisir le tissu conjonctif orbitale et le nerf optique derrière le globe tout en faisant attention à ne pas écraser le monde. </li><li> Tirez doucement sur le pince vers le haut et arracher le globe oculaire hors de l'orbite. Le fil blanc-comme le tissu est le nerf optique. </li><li> Placez l'œil dans du PBS. En utilisant une aiguille de calibre 30, faire une ponction unique liquidée immédiatement en arrière du limbe en insérant l'aiguille 1-2 mm dans le globe oculaire. Ceci permet fixateurs, tels que le glutaraldéhyde, qui sont dans l'impossibilité de pénétrer dans le tissu oculaire, directement enter l'œil. Création de cette piqûre peut ne pas être nécessaire si un fixateur comme le paraformaldéhyde ou l'alcool, est capable de diffuser dans les tissus oculaires d'intérêt. </li><li> Placez l'œil entier immédiatement dans fixateur pour la fixation d'immersion. </li></ol> 2. Dissection Sharp: énucléation de la fixation de la souris oeil perfusion suivante <ol><li> Utilisez une pince courbe colibri de tenir la paupière loin du monde. </li><li> Orienter les courbes ciseaux à dissection Westcott parallèles au monde, tout en visant vers l'arrière de l'orbite. </li><li> Coupez le tissu conjonctif qui entoure fixe le monde des inférieures, médianes, les côtés supérieurs et latéraux. </li><li> Placez la pince courbée derrière le globe, tenez le tissu conjonctif sans appuyer sur le globe, et tirer vers l'avant pour énucléer l'œil. Puisque le tissu conjonctif orbitale est raide de fixation par perfusion, coupe supplémentaire des tissus orbitaires peut être nécessaire pour libérer complètement le globe. </li></ol> 3. Fixation et d'emballage Livraison de tissus fixés doivent respecter vos obligations de service postal et institutionnels, y compris des étiquettes et des emballages. Le protocole suivant est un exemple de l'expédition d'un échantillon non biologique infectieux à température ambiante. Cela nécessite 3 couches de l'emballage mais pas de classe A substance / B biologiques ou des étiquettes d'azote liquide. <ol><li> Placez l'oeil dans un flacon de 5 ml à scintillation en verre avec au moins 3 ml de fixateur, ou post-fixateur de mémoire tampon si la fixation est courte. Écrivez le numéro de suivi sur le couvercle du flacon et le sceller avec du parafilm. </li><li> Placer les flacons à scintillation dans un échantillon biologique approuvé conteneur d'expédition. Dans notre institut, par exemple, des contenants approuvés besoin de trois couches: un conteneur étanche dans lequel l'échantillon est placé, une couche intermédiaire absorbante et une couche externe protectrice. </li><li> Placer le récipient dans un emballage plastique-bulles, puis dans une applicationparcouraient conteneur d'expédition de laboratoire ainsi que la documentation appropriée. </li></ol> 4. Les résultats représentatifs L'examen histologique des yeux peut être effectuée par une variété de méthodes, y compris l'hématoxyline et coloration à l'éosine, détection de l'expression enzymatique, microscopie électronique à transmission, et l'immunohistochimie. Après fixation par immersion dans du paraformaldéhyde 4%, le tissu a été inclus dans la paraffine et sectionnés au microtome. Dans le phénotypage à haut débit, nous analysons les sections nerveuses élève optique que l'échantillon tous les types de tissus de l'œil (figure 1). Des morceaux de tissu ont également été examinées pour l'expression de lacZ (figure 2), la microscopie électronique à transmission des organites cellulaires (figure 3), et l'expression de molécules spécifiques avec des anticorps (figure 4). Dans notre méthode de dépistage phénotype, ce n'était pas important pour maintenir l'orientation de l'oeil par rapport au nasal (canthus interne) et temporelle (lateral) canthus côtés. Il ya au moins deux options si l'orientation des yeux est nécessaire. Après énucléation, nous avons appliqué la cautérisation lumière sur la cornée temporelle à la position trois heures avec un dispositif de cautérisation de poche. La lésion est évident sur l'histologie et de ne pas se perdre pendant le traitement, comme les encres histologiques. L'inconvénient est que les dommages cautérisation de la cornée, ce qui peut être un tissu essentiel pour examen. L'autre option nécessite un anatomiste habile qui permet d'identifier les insertions musculaires extra-oculaires. Sous un stéréomicroscope, l'identification de l'insertion du muscle oblique inférieur et supérieur constitue l'aspect inférieur et supérieur et de la planète 3. Que soit la méthode d'orientation, il est important de suivre le spécimen comme l'œil droit ou gauche. Ensemble, ce qui permettra l'orientation exacte monde avant la coupe. <img src="/files/ftp_upload/3184/3184fig1.jpg" alt="Micrographie d’anatomie de l’œil ; coupes d’histologie ; cristallin, rétine, cornée ; Détails de la couche cellulaire." data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Images des yeux de souris histologiques afte r distance acquisition. yeux de souris ont été énucléés par dissection après la fixation de perfusion avec du paraformaldéhyde 4%. A. Nombre d'élèves par section du nerf optique colorées à l'hématoxyline et à l'éosine montre préservation de toutes les structures tissulaires. ON, le nerf optique. (Barre d'échelle verte = 500 microns) B. Une vue plus fort grossissement de la rétine normale montre sa structure laminaire: RGC, les cellules ganglionnaires de la rétine; IPL, couche interne plexiforme; INL, couche nucléaire interne; OPL, couche externe plexiforme; ONL, extérieur la couche nucléaire (cellules photoréceptrices) (flèche); IS, les segments des photorécepteurs internes (tête de flèche); OS, photorécepteurs segments extérieurs; RPE, l'épithélium pigmentaire rétinien; C, choroïde. (Barre d'échelle verte = 50 microns) C. Par rapport à la rétine normale, ce spécimen est plus mince en raison de la dégénérescence des photorécepteurs. L'ONL, IS et OS sont totalement absents (flèche). (Échelle bar vert = 50 microns) "Alt =" Figure 2 "/&gt; Figure 2. L'expression de lacZ dans des souris transgéniques. Yeux ont été énucléés par dissection et immergé dans 1 mg / ml solution X-gal (5 mM K3Fe (CN) 6, 5 mM K4Fe (CN) 6, 2 mM de MgCl2, 0,02% de NP40 , et le désoxycholate de sodium 0,1%) pendant une nuit à 37 ° C. Les yeux étaient fixés dans du glutaraldéhyde formaldehyde/0.2% 2% pendant 30 minutes et en coupe au microtome. X-gal produits (bleu) étiquettes: A. épithélium ciliaire, B. épithélium de la cornée, et C. de la cellule rétinienne ganglion (RGC) couche de la rétine. INL, couche nucléaire interne; ONL, couche nucléaire externe. <img src="/files/ftp_upload/3184/3184fig3.jpg" alt="Structure rétinienne ; Micrographie électronique montrant les segments externes des bâtonnets, les cellules EPR, la membrane de Bruch." data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> Figure 3. Microscopie électronique à transmission de l'épithélium pigmentaire rétinien (EPR). Après dissection et la création d'une plaie perforante, les yeux étaient fixés par immersion dans du paraformaldéhyde à 2,5% / 2,5% de glutaraldéhyde dans un tampon 0,1 M phosphate de sodium. Les yeux étaient de secondedarily fixé dans textroxide osmium à 1%, peu à peu déshydraté, et noyé dans une résine de Spurr. Tissu a été coupé à 90 nm et placés sur des grilles de cuivre sous couvert de Formvar et imagée à l'aide d'un microscope électronique à transmission. La micrographie montre, segments externes des photorécepteurs de la rétine neurosensorielle, mélanosomes (M) dans l'épithélium pigmentaire de la rétine et la membrane de Bruch. <img src="/files/ftp_upload/3184/3184fig4.jpg" alt="Image par microscopie fluorescente de la structure du biofilm bactérien ; Grossissement à l’échelle de 20 microns." data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> Figure 4. Marquage immunohistochimique de la superoxyde dismutase-3 (verte) dans le corps vitré de la souris. Yeux ont été énucléés par dissection et a subi une fixation immersion dans du paraformaldéhyde à 4%. Ils ont été inclus dans la paraffine et sectionnés à l'aide d'un microtome. Les coupes de tissu ont été incubées avec un antisérum polyclonal de lapin SOD3 dilué à 1:50. SOD3 expression a été détectée en utilisant un anticorps de chèvre anti-IgG de lapin (H + L)-Alexa Fluor 488 anticorps secondaire conjugué. L'étiquetage des SOD3 est indiqué dans grefr.

<ol><li>Song, B. J., Tsang, S. H., Lin, C. -S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+models+of+retinal+degeneration+and+targets+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic models of retinal degeneration and targets for gene therapy.</a> Gene Ther. Mol. Biol. 11, 229-262 (2007).</li>
<li>Mahajan, V. B., Mondino, B. J., Tsang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+Mouse+Eye+Phenomics+System%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Laboratories%2C+Mouse+Genetics+Meeting%22%5BJournal%5D)">A high-throughput Mouse Eye Phenomics System.</a> Cold Spring Harbor Laboratories, Mouse Genetics Meeting. , (2010).</li>
<li>Smith, R. S., John, S. W. M., Nishina, P. M., Sundberg, J. P. In Research Methods For Mutant Mice. , CRC Press. Boca Raton, FL. (2002).</li>
<li>Chang, B., Hawes, N. L., Hurd, R. E., Davisson, M. T., Nusinowitz, S., Heckenlively, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+degeneration+mutants+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">Retinal degeneration mutants in the mouse.</a> Vision Res. 42, 517-525 (2002).</li>
<li>Anderson, M. G., Smith, R. S., Hawes, N. L., Zabaleta, A., Chang, B., Wiggs, J. L., John, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+genes+encoding+melanosomal+proteins+cause+pigmentary+glaucoma+in+DBA%2F2J+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Mutations in genes encoding melanosomal proteins cause pigmentary glaucoma in DBA/2J mice.</a> Nat. Genet. 30, 81-85 (2002).</li>
<li>Hawes, N. L., Smith, R. S., Chang, B., Davisson, M., Heckenlively, J. R., John, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+fundus+photography+and+angiography%3A+a+catalogue+of+normal+and+mutant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Vis%22%5BJournal%5D)">Mouse fundus photography and angiography: a catalogue of normal and mutant phenotypes.</a> Mol. Vis. 5, 22-22 (1999).</li>
<li>Won, J., Shi, L. Y., Hicks, W., Wang, J., Hurd, R., Naggert, J. K., Chang, B., Nishina, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+model+resources+for+vision+research%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Mouse model resources for vision research.</a> J. Ophthalmol. 2011, 391384-391384 (2011).</li>
<li>Pinto, L. H., Vitaterna, M. H., Siepka, S. M., Shimomura, K., Lumayag, S., Baker, M., Fenner, D., Mullins, R. F., Sheffield, V. C., Stone, E. M., Heffron, E., Takahashi, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Results+from+screening+over+9000+mutation-bearing+mice+for+defects+in+the+electroretinogram+and+appearance+of+the+fundus%5BTitle%5D)+AND+%22Vision.+Res%22%5BJournal%5D)">Results from screening over 9000 mutation-bearing mice for defects in the electroretinogram and appearance of the fundus.</a> Vision. Res. 44, 3335-3345 (2004).</li>
<li>Heckenlively, J. R., Winston, J. V., Roderick, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+for+mouse+retinal+degenerations.+I.+Correlation+of+indirect+ophthalmoscopy%2C+electroretinograms%2C+and+histology%5BTitle%5D)+AND+%22Doc.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Screening for mouse retinal degenerations. I. Correlation of indirect ophthalmoscopy, electroretinograms, and histology.</a> Doc. Ophthalmol. 71, 229-239 (1989).</li>
<li>Tsang, S. H., Gouras, P., Yamashita, C. K., Kjeldbye, H., Fisher, J., Farber, D. B., Goff, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+degeneration+in+mice+lacking+the+gamma+subunit+of+the+rod+cGMP+phosphodiesterase%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Retinal degeneration in mice lacking the gamma subunit of the rod cGMP phosphodiesterase.</a> Science. 272, 1026-1029 (1996).</li>
<li>Tsang, S. H., Woodruff, M. L., Jun, L., Mahajan, V., Yamashita, C. K., Pedersen, R., Lin, C. S., Goff, S. P., Rosenberg, T., Larsen, M., Farber, D. B., Nusinowitz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+mice+carrying+the+H258N+mutation+in+the+gene+encoding+the+beta-subunit+of+phosphodiesterase-6+%28PDE6B%29+provide+a+model+for+human+congenital+stationary+night+blindness%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mutat%22%5BJournal%5D)">Transgenic mice carrying the H258N mutation in the gene encoding the beta-subunit of phosphodiesterase-6 (PDE6B) provide a model for human congenital stationary night blindness.</a> Hum. Mutat. 28, 243-254 (2007).</li>
</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

La plupart des souris transgéniques existent dans les laboratoires qui n&#39;examinent pas les yeux. Notre technique vidéo illustre une méthode simple et standardisé pour le transfert de compétences à distance chirurgicale afin d&#39;optimiser l&#39;acquisition des tissus provenant de laboratoires ayant peu d&#39;expérience avec les yeux. Cette technique aide à surmonter vidéo un écueil majeur dans le phénotypage à haut débit, qui est l&#39;utilisation d&#39;un nombre limité de sites spécialisés en raison de méthodes de...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom </th><th> Entreprise </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commentaires </th></tr><tr><td> Pince courbe Dressing </td><td> Storz Ophthalmics </td><td> E1408 </td><td></td></tr><tr><td> Mahajan Sharptip pansement pince </td><td> Storz Ophthalmics </td><td> E1406 (REF SP7-64520) </td><td></td></tr><tr><td> Ciseaux courbes Westcott </td><td> Storz Ophthalmics </td><td> E3321 WH </td><td></td></tr><tr><td> 15 ° BD Beaver microchirurgicale de la lame </td><td> Becton-Dickinson </td><td> 374881 </td><td></td></tr><tr><td> 0,22 Fine-Castroviejo Forceps suture </td><td> Storz Ophthalmics </td><td> E1805 </td><td></td></tr><tr><td> 0,12 pince Colibri </td><td> Storz Ophthalmics </td><td> 2/132 </td><td></td></tr><tr><td> 30-aiguille de calibre </td><td> Becton-Dickinson </td><td> 305128 </td><td></td></tr><tr><td> Biohazard Mailer </td><td> Pêcheur </td><td> 03-523-4 </td><td></td></tr><tr><td> Parafilm </td><td> Pêcheur </td><td> 13-374-10 </td><td></td></tr><tr><td> Verre flacons à scintillation </td><td> Wheaton </td><td> 4500413033 </td><td></td></tr><tr><td> PBS, pH 7,4 </td><td> Invitrogen </td><td> 70011-044 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldéhyde 16% </td><td> Sciences microscopie électronique </td><td> 15700 </td><td></td></tr><tr><td> 2,5% paraformaldéhyde / glutaraldéhyde 2,5% dans 0,1 M de tampon phosphate de sodium </td><td> Sciences microscopie électronique </td><td> 15700 &amp; 16300 </td><td> Mixé en laboratoire </td></tr><tr><td> Glutaraldéhyde à 50% </td><td> Sciences microscopie électronique </td><td> 16300 </td><td></td></tr><tr><td> 0,25% Formvar </td><td> Sciences microscopie électronique </td><td> 15810 </td><td></td></tr><tr><td> Flicpar grille fente </td><td> Sciences microscopie électronique </td><td> M2010-CR </td><td></td></tr><tr><td> Tétroxyde d&#39;osmium 4% </td><td> Sciences microscopie électronique </td><td> 19140 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-SOD3 anticorps </td><td> Abcam </td><td> Ab21974 </td><td></td></tr><tr><td> Chèvre anti-lapin Alexa Fluor 488 </td><td> Invitrogen </td><td> A11070 </td><td></td></tr><tr><td> Résine de Spurr intégration </td><td> Sciences microscopie électronique </td><td> 14300 </td><td></td></tr></tbody></table>

l&#39;énucléation des yeux de souris à distance pour le phénotypage à haut débit

Mouse Eye Enucleation for Remote High-throughput Phenotyping

L&#39;œil de la souris est un modèle important pour l&#39;étude génétique de translation de la maladie ophtalmique humaine. Prévenir la cécité chez l&#39;homme, telles que la dégénérescence maculaire, la dégénérescence des photorécepteurs, la cataracte, le glaucome, le rétinoblastome, et la rétinopathie diabétique ont été récapitulés dans les souris transgéniques. 5.1 La plupart des souris transgéniques et knock-out ont été générées par les laboratoires pour étudier les maladies non ophtalmiques, mais conservation des ressources génétiques entre les systèmes d&#39;organes suggère que bon nombre des mêmes gènes peuvent également jouer un rôle dans le développement oculaire et les maladies. Par conséquent, ces souris constituent une ressource importante pour la découverte de nouvelles corrélations génotype-phénotype dans les yeux. Parce que ces souris sont dispersés à travers le monde, il est difficile d&#39;acquérir, de conserver et de les phénotype d&#39;une manière efficace, rentable. Ainsi, la plupart des écrans à haut débit phénotypage ophtalmiques sont limités à quelques endroits qui ont besoin sur place, l&#39;expertise ophtalmologique pour examiner les yeux chez des souris vivantes. 9.6 Une approche alternative développée par notre laboratoire est une méthode de tissus acquisition à distance qui peut être utilisé dans les enquêtes à petite ou grande échelle des yeux de souris transgéniques. Les procédures standardisées pour la vidéo basée sur le transfert de compétences chirurgicales, la fixation des tissus, et l&#39;expédition permettre à tout laboratoire pour recueillir les yeux entiers à partir d&#39;animaux mutants et les envoyer pour le phénotypage moléculaire et morphologique. Dans cet article, vidéo, nous vous présentons des techniques pour énucléer et transférer à la fois non fixées et la perfusion yeux fixes souris pour les analyses de phénotypage à distance.

La technique de dissection illustre énucléation de l&#39;oeil de la souris pour la fixation des tissus pour réaliser le phénotypage à haut débit écrans.

L&#39;énucléation des yeux de souris à distance pour le phénotypage à haut débit

L'œil de souris constitue un modèle génétique important pour l'étude translationnelle des pathologies ophtalmiques humaines. Les maladies entraînant la cécité chez l'homme, telles que la dégénérescence maculaire...

Ce vidéo montrera l'œil de la souris et la désinsertion, ou l'ablation du globe oculaire de la cavité orbitaire. Le globe oculaire est délimité par la marge de la paupière inférieure. Voici le canthus médial ou nasal.À l’arrière se trouve le canthus temporal ou latéral. Au-dessus se situe la marge de la paupière supérieure. Voici un spécimen chirurgical.L'aiguille pointe vers la cornée transparente. On peut voir un peu du cristallin qui dépasse au-delà de l'iris. L'iris est ici en marron, recouvrant le cristallin.Le repère chirurgical le plus important est cette ligne blanche, ou le limbe, où sera réalisée une brèche juste en arrière. La moitié postérieure du globe se situe en arrière du limbe, et nous indiquons ici une insertion musculaire. On peut voir le muscle appliqué contre le globe à cet endroit, puis le tissu conjonctif qui remplit l’orbite et comprend la glande d’Airant.Et enfin, ceci est la longue bande blanche du nerf optique provenant d'une dissection émoussée. À l'aide d'une pince à pansement courbe, modifiée avec une pointe aiguë, commencez par écarter les paupières. Cela a tendance à faire ressortir l'œil vers l'extérieur.Utilisez soigneusement votre pince pour pénétrer dans l’orbite et passer derrière le globe oculaire, comprimez délicatement la zone située à l’arrière du globe sans l’écraser, puis tirez vers l’avant. Vous devriez avoir saisi le tissu conjonctif et non le globe oculaire. Si vous déplacez le globe oculaire sur le côté, vous pouvez observer le tissu orbital ainsi que le nerf optique blanc.Cette deuxième dissection a pour but de montrer à nouveau que l'on pénètre au niveau du canthus, que l'on introduit la pince derrière le globe oculaire, que l'on saisit le tissu conjonctif, puis que l'on tire vers l'avant sans appuyer directement sur le globe oculaire lui-même. On peut encore observer le tissu conjonctif dans la longue bande blanche du nerf optique. Pour créer une plaie perforante, saisissez le globe oculaire par une insertion musculaire et insérez une aiguille derrière le limbe, juste à côté de l'endroit où vous tenez l'œil afin de le stabiliser.Cela permettra au fixatif d'entrer dans l'œil. Si vous effectuez la perforation loin de l'endroit où vous tenez l'œil, le globe oculaire sera très instable, et il sera difficile de réaliser cette incision aussi longtemps que vous n'écrasez pas l'œil ou n'appliquez pas une pression excessive. Vous pouvez également saisir tous les tissus conjonctifs situés juste derrière le globe oculaire lui-même.Certains fixateurs ne nécessitent pas de plaie par ponction. En général, on place l’œil dans un flacon de scintillation de cinq cm³ contenant au moins trois cm³ de fixateur afin de s’assurer que l’œil est complètement immergé. Pour les animaux fixés par perfusion, une dissection fine est nécessaire.Nous utilisons une pince courbe en calibri et des ciseaux courbes de Wescott. Saisissez la paupière inférieure avec la pince en calibri. Insérez vos ciseaux contre l'os orbital, puis commencez à couper le tissu conjonctif.Nous utilisons la courbe en s'éloignant du globe oculaire et évitons le calibrage. N'importe quelle partie de l'œil convient tout le long de la marge de la paupière inférieure, d'un canthus à l'autre. À un certain endroit, la majeure partie du tissu conjonctif sera retirée, et vous pourrez glisser vos ciseaux derrière le globe et l'écarter.Voici un autre exemple, où l'on insère les ciseaux dans l'orbite, mais contre l'os orbital plutôt que contre le globe oculaire, en sectionnant délicatement les tissus conjonctifs. Cela commence à libérer le globe oculaire, qui ressemble à un ballon de basket dans son panier. Utilisez la pince pour écarter les paupières et effectuez de légers petits incisions tout autour du globe oculaire.Ici, nous saisissons le tissu conjonctif ou une insertion musculaire avec le Collibra et terminons en détachant le globe oculaire du tissu conjonctif orbitaire. Une fois les globes oculaires correctement fixés, et s'ils doivent être transportés, nous plaçons un film parafilm autour du flacon de stockage.L'emballage doit être conforme aux réglementations de votre université et du gouvernement. Nous plaçons généralement ceux-ci dans un récipient contenant un peu de coton pour retenir tout liquide ; ce récipient doit être hermétiquement scellé. Ce contenant d'expédition est ensuite placé dans un sac en papier bulle.Ceci est placé dans un emballage de transport pour liquides en laboratoire, accompagné de tous les documents nécessaires.

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Ce protocole décrit une méthode simple et peu coûteux afin de quantifier l'activité des éléments cis-régulateurs (par exemple, enhancer / promoteur) dans la vie des rétines de souris par électroporation explant. Analyse préparation de l'ADN, la dissection de la rétine, l'électroporation, la culture des explants rétiniens, et post-fixation et de quantification sont décrits.

Quantifier l&#39;activité des Cis Éléments de la réglementation-dans la rétine de souris par électroporation explantation

Source : Jagodzinska, J., et. al., Tomographie par cohérence optique : imagerie des cellules ganglionnaires rétiniennes de souris In Vivo. J. Vis. Exp. (2017)  Dans cette vidéo, nous démontrons l’utilisation de la tomographie par cohérence optique dans le domaine spectral (SD-OCT) pour imager les couches rétiniennes et évaluer les changements structurels dans un modèle de souris génétiquement modifié avec neuropathie optique.

Imagerie in vivo de la rétine de souris par tomographie par cohérence optique

La suppression des yeux, aussi appelé l'énucléation, fournit une stratégie utile pour étudier les aspects de visuel, multi-modal, et la plasticité du développement le long du système visuel des mammifères, car il induit irréversible partielle (monoculaire) ou complète (binoculaire) la perte de vision. Nous décrivons ici une approche hautement reproductible et simple à effectuer dans l'énucléation in vivo.

Une méthode hautement reproductible et facile à Effectuer In Vivo Oculaire énucléation chez la souris après ouverture des yeux

Dans cet article, nous décrivons les principes de conception et de réalisation d’une expérience de traçage de lignage multicolore à l’aide de souris R26R-Confetti. Nous fournissons un protocole spécifique pour le suivi des cellules épithéliales cornéennes qui peuvent être modifiées pour d’autres tissus d’intérêt.

Une méthode pour Lineage Tracing de cellules de la cornée Utilisation du Multi-couleurs Souris rapporteur fluorescent

Nous démontrons une nouvelle approche à l’utilisation de tomographie à cohérence optique domaine spectral haute résolution (HR-SD-OCT) pour aider l’administration d’agents de thérapie génique dans l’espace sous-rétinienne, évaluer sa couverture areal et caractériser la vitalité des photorécepteurs.

Tomographie à cohérence optique souris ultra haute résolution pour faciliter l’Injection intraoculaire dans la recherche de la thérapie génique rétinienne

Présenté ici est une plate-forme microscopique multiphoton pour l’imagerie de surface oculaire de souris vivante. La souris transgénique fluorescente permet la visualisation des noyaux cellulaires, des membranes cellulaires, des fibres nerveuses et des capillaires à l’intérieur de la surface oculaire. Les signaux non linéaires de deuxième génération harmonique dérivés de structures collagènes fournissent une imagerie sans étiquette pour les architectures stromales.

Une plate-forme personnalisée de microscopie multiphoton pour l’imagerie en direct de la cornée de souris et de la conjonctive

L’imagerie in vivo est un outil puissant pour l’étude de la biologie dans la santé et la maladie. Ce protocole décrit l’imagerie transpupillaire de la rétine de la souris avec un microscope standard à deux photons. Il démontre également différentes méthodes d’imagerie in vivo pour marquer par fluorescence plusieurs cohortes cellulaires de la rétine.

Transpupillaire Imagerie in vivo à deux photons de la rétine de souris

Ce protocole, qui a été initialement rapporté par Fernandez-Godino et coll. en 20161, décrit une méthode pour isoler efficacement et culturer les cellules RPE de souris, qui forment un monocouche RPE fonctionnel et polarisé en moins d’une semaine sur les plaques Transwell. La procédure dure environ 3 heures.

Dissection efficace et culture des cellules épithéliales rétiniennes primaires de pigment de souris

Cet article présente un protocole pour la microdissection oculaire chez les rongeurs. Le processus implique l’énucléation du globe oculaire avec la membrane nictitante (c’est-à-dire la troisième paupière). Ceci est ensuite suivi par la séparation des cupules postérieures et antérieures.

Microdissection de l’œil de rongeur

La rétine présente une organisation spatiale complexe à travers sa structure laminaire. Les techniques modernes de transcriptomique spatiale et de séquençage nécessitent des coupes de tissus &lt; 20 μm d’épaisseur, ce qui limite leur applicabilité à la recherche rétinienne. Cette méthode de cryosectionnement fraîchement congelée produit de fines sections de la rétine de la souris tout en préservant les relations spatiales planes, permettant une cartographie moléculaire complète à travers les...

En face Cryosectionnement de la rétine de souris pour l’analyse moléculaire spatiale de haute dimension

Cet article démontre une méthode pour visualiser et quantifier la motilité et le contact de la microglie avec les points postsynaptiques de la rétine à l’aide de la microscopie confocale à disque tournant.

Imagerie en direct et caractérisation de la dynamique de la microglie et des interactions avec les synapses dans la rétine murine malade

Apprenez l'énucléation des yeux de souris pour le phénotypage à haut débit en neurosciences. Cette technique permet la fixation tissulaire précise et améliore les résultats des études phénotypiques.

L'énucléation des yeux de souris à distance pour le phénotypage à haut débit

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