Imagerie de la libération de neurotransmetteurs à l’aide de rapporteurs fluorescents de neurotransmetteurs à base de cellules

Prenez une souris avec une fenêtre crânienne contenant une fine couche de crâne pour permettre la visualisation du cerveau.

Le mouvement de la tête est limité à l’aide d’une barre de tête attachée.

Le cortex est pré-injecté de neurotransmetteurs fluorescents (CNiFER), qui sont des cellules rapporteures qui permettent la détection en temps réel de la libération de neurotransmetteurs.

Les CNiFER expriment un récepteur de neurotransmetteur couplé aux protéines G et un détecteur de calcium cytoplasmique, qui consiste en un domaine de liaison au calcium fusionné à des fluorophores donneurs et accepteurs.

À l’aide d’un microscope à deux photons, excitez le détecteur pour provoquer l’émission de fluorescence du donneur et activez la visualisation CNiFER.

L’activité neuronale atteignant le cortex provoque la libération de neurotransmetteurs.

Ces neurotransmetteurs se lient aux récepteurs CNiFER et activent les voies de signalisation qui induisent la libération de calcium du réticulum endoplasmique.

L’augmentation du calcium cytoplasmique se lie au détecteur, provoquant un changement de conformation qui rapproche les fluorophores.

Le donneur transfère de l’énergie à l’accepteur pour stimuler l’émission de fluorescence de l’accepteur, indiquant la libération de neurotransmetteurs.

Placez la plate-forme d’imagerie avec la souris retenue par la tête sous un objectif d’immersion dans l’eau 10x dans un microscope imageur à deux photons. Insérez le cube de filtre pour l’imagerie par frettes qui a un miroir dichroïque à 505 nanomètres et des filtres passe-bande qui s’étendent de 460 nanomètres à 500 nanomètres pour mesurer l’ECFP et de 520 nanomètres à 560 nanomètres pour mesurer Citron.

Ajoutez ensuite l’ACSF dans le puits, contenant la fenêtre du crâne amincie, et abaissez l’objectif d’immersion dans l’eau 10x dans l’ACSF. Utilisez l’oculaire, en conjonction avec une lampe au mercure et un cube de filtre GFP pour localiser les cNIFER. Maintenant, passez à l’objectif d’immersion dans l’eau 40x.

Ensuite, sélectionnez le chemin lumineux approprié pour l’imagerie à deux photons. Allumez le laser pulsé femtoseconde dans le proche infrarouge. Sélectionnez la longueur d’onde de 820 nanomètres et un réglage de puissance de 5 à 15 %. Réglez la tension PMT1 et PMT2 à une valeur sous-maximale, généralement de 500 à 1000 volts, selon le PMT.

Réglez ensuite le gain sur 1 pour chaque canal et 0 sur la position Z pour l’objectif. Abaissez l’objectif à environ 100 à 200 micromètres de la surface corticale et lancez le balayage x, y. Ajustez le gain de puissance laser et la tension PMT pour chaque voie afin d’optimiser le rapport signal/bruit de la fluorescence cNIFERs.

Ensuite, utilisez le logiciel pour restreindre l’imagerie à une région qui contient les cellules cNIFERs ainsi qu’une région d’arrière-plan. Sélectionnez la moyenne de la ligne de Kalman pour deux pour obtenir un rapport signal/bruit approprié, et utilisez une fréquence de balayage de 0,3 à 1 hertz à 4 microsecondes par pixel. Après cela, dessinez un retour d’intérêt autour des cellules cNIFER, entourant environ trois à quatre cellules par plan.

Mettez en place une analyse en temps réel des intensités moyennes du ROI. Ensuite, commencez l’acquisition pour surveiller la fluorescence de cNIFER au fil du temps, et commencez la stimulation électrique ou une expérience comportementale tout en surveillant l’agitation.