Hyperinsulinémique euglycémique-pinces dans Conscient, Souris illimités

L'objectif général de l'expérience suivante est d'évaluer l'action de l'insuline au niveau de l'organisme entier et de tissus spécifiques chez des souris conscientes non stressées, sans manipulation directe. Ceci est réalisé par l'implantation chirurgicale d'un cathéter dans la veine jugulaire pour les perfusions et d'un autre dans l'artère carotide afin de prélever des échantillons sanguins. Après une période de récupération de cinq à sept jours, les souris, privées d'aliment pendant cinq heures, sont perfusées avec de l'insuline afin d'obtenir une hyperinsulinémie physiologique.

Les taux de glucose sont ensuite mesurés à partir du cathéter artériel, et la glycémie à jeun est maintenue en ajustant le débit d'infusion de glucose. Cette expérience permet de mesurer les différences de sensibilité à l'insuline au niveau de l'organisme entier, en se basant sur la relation directe entre le débit d'infusion de glucose nécessaire pour maintenir la glycémie à jeun et l'action de l'insuline. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes d'échantillonnage sanguin, comme la section de la queue, est que le cathéter artériel implanté chirurgicalement nous donne un accès vasculaire à la souris, ce qui nous permet d'obtenir des échantillons sanguins sans avoir à manipuler l'animal.

Cela nous permet donc de réaliser ces expériences sur des souris non stressées et non contraintes. Le cathéter artériel est fabriqué en insérant un morceau biseauté de tube PE 10 dans un morceau de six centimètres de tube astic, de sorte que le PE 10 dépasse de 0,9 centimètre par rapport au sel. Le cathéter veineux est un morceau de tube SEL de six centimètres équipé d’un collier.

La masa est construite en insérant des morceaux de 3 centimètres de PE 20 dans chacun des deux connecteurs en acier inoxydable de 1,3 centimètre et 25 gauge, Ben, formant un angle d'environ 120 degrés. Ceux-ci sont insérés dans une petite quantité d'adhésif médical en silicone comme indiqué ici. Pour commencer l'implantation du cathéter, placez une souris anesthésiée sur une surface de travail propre en utilisant une technique stérile. Pratiquez une incision de cinq millimètres à droite de la ligne médiane.

Isolez la veine jugulaire droite. Ligaturez soigneusement la veine céphalique, terminez par une suture en soie et faites un nœud lâche avec un autre morceau de suture à l'extrémité caudale. Ensuite, coupez juste en dessous de la ligature céphalique avec des ciseaux à ressort et insérez le cathéter jusqu'au point d'arrêt.

Faire un nœud de suture derrière la bille et vérifier que le cathéter prélève correctement en raccordant l'extrémité libre du cathéter à une seringue de prélèvement. Pour poser le cathéter artériel, pratiquer une petite incision, à cinq millimètres à gauche du sternum et au niveau céphalique de la première incision. Isoler l'artère carotide gauche, puis ligaturer le segment céphalique.

Terminer par un point de suture en soie et faire un nœud lâche. Placer un autre morceau de suture à l'extrémité causale du vaisseau exposé. Ensuite, pincer l'extrémité codale du vaisseau.

Et couper juste en dessous de l'extrémité ligaturée avec des ciseaux à ressort. Insérer soigneusement le cathéter jusqu'au niveau du clamp. Relâcher délicatement le clamp et avancer le cathéter jusqu'à la jonction Astic P.

Fixez solidement les ligatures au cathéter et vérifiez le prélèvement par le cathéter en connectant l'extrémité libre du cathéter à une seringue de prélèvement. Ensuite, retournez l'animal et faites une petite incision entre les omoplates, puis passez une aiguille de calibre 14 sous la peau depuis les incisions antérieures jusqu'à cette incision dorsale. Passez les cathéters à travers l'aiguille pour les extérioriser à l'arrière de la souris.

Connecter les cathéters artériel et veineux aux raccords appropriés sur l'antenne de la souris pour l'accès à l'échantillonnage ou au masa. Ensuite, insérer le masa dans l'incision située entre les omoplates. Fermer les deux incisions à l'aide d'un fil de suture en nylon.

Confirmer la perméabilité des deux cathéters. Placer la souris dans une cage propre et chauffée pour la récupération, et laisser la souris se remettre au moins cinq jours avant le clamp d'insuline. L'étape la plus délicate lors de la réalisation d'un clamp hyperinsulinémique euglycémique chez la souris consiste à maintenir l'euglycémie.

Les souris ont un métabolisme très rapide et leurs taux de glucose peuvent varier sensiblement pendant la durée de l'expérience. Cela nécessite un peu de pratique pour apprécier comment le taux de glucose d'une souris évoluera au cours d'une expérience, puis pour ajuster le débit d'infusion de glucose afin de maintenir une glycémie constante. Le montage pour un clamp standard est illustré ici.

Trois perfuseurs contenant respectivement du sérum physiologique, de l'insuline-glucose et des érythrocytes lavés sont reliés à un raccord en téflon à quatre voies, lui-même connecté à un rotateur suspendu au-dessus de la souris. Le port de perfusion du rotateur est relié au cathéter veineux. Avant de connecter la souris, remplir entièrement les lignes des trois perfuseurs avec du sérum physiologique.

Ensuite, remplissez la ligne d'échantillonnage avec du sérum salé hépariné. Laissez une seringue contenant du sérum salé hépariné reliée à l'extrémité supérieure du raccord rotatif, qui servira de seringue de purge. Commencez à jeûner les souris cinq à six heures avant le début du clamp.

À trois heures d'intervalle dans le jeûne, peser la souris et raccorder respectivement les cathéters veineux et artériels aux lignes d'infusion et de prélèvement. Quinze minutes avant le début du clamp, insérer une perfusion de glucose témoin dans un glucomètre portable. Ensuite, prélever environ 50 microlitres de sang dans la seringue de lavage afin d'éliminer tout résidu de sérum physiologique de la ligne, puis détacher la seringue de lavage.

Measurez le taux de glucose sanguin en appliquant la bandelette de glucose sur la goutte de sang qui se forme à l'extrémité du tube. Ensuite, insérez une seringue munie d'une aiguille émoussée dans la ligne d'échantillonnage et aspirez 50 microlitres de sang. Déposez le sang dans un tube recouvert d'EDTA et centrifugez le tube afin de recueillir le plasma pour les mesures des hormones et métabolites de base.

À ce stade, réinsérez la seringue de purge et tirez sur le piston. Pour éliminer les bulles d'air, réinjectez les 50 microlitres de sang initialement prélevés. Notez la valeur de la glycémie indiquée par le glucomètre.

10 minutes plus tard, utilisez le glucomètre et la seringue de rinçage pour répéter la mesure de la glycémie, puis prélève encore 50 microlitres de sang afin d'obtenir un autre échantillon de plasma. Après avoir effectué les deuxièmes mesures de base, remplissez les lignes d'infusion de glucose, d'insuline et d'érythrocytes lavés au sérum salin jusqu'au connecteur en croix. Connectez le connecteur en croix au tube fixé au port d'infusion rotatif.

Commencez par l'infusion des érythrocytes lavés au sérum salin. Réglez le débit d'infusion de manière à remplacer le volume total de sang prélevé pendant la durée de l'étude. Une fois que l'infusion d'érythrocytes atteint la souris, commencez les perfusions d'insuline et de glucose.

Ceci correspond à un temps égal à zéro minute. L'insuline est perfusée à un débit constant prédéterminé. Le débit initial de perfusion de glucose est estimé à partir des concentrations sanguines de glucose de base et de l'expérience antérieure.

Au cours des deux heures suivantes, effectuez des mesures de la glycémie à l’aide du glucomètre et ajustez le débit d’infusion de glucose pour maintenir une glycémie cible. Toutes les 10 minutes, enregistrez les nouvelles valeurs de glycémie et les débits d’infusion de glucose aux temps 100 minutes et 120 minutes, puis prélèvez du sang supplémentaire pour la mesure de l’insuline plasmatique ainsi que d’autres hormones ou métabolites éventuels. Le graphique ci-dessous illustre l’évolution temporelle des concentrations de glucose tout au long de la procédure de clampage, montrant la bonne stabilité de la glycémie chez les souris nourries avec un régime standard et chez celles soumises à un régime riche en lipides. L’évolution temporelle du débit d’infusion de glucose montre que le débit nécessaire pour maintenir une glycémie cible est significativement plus faible dans le groupe soumis au régime riche en lipides, indiquant une altération de l’action globale de l’insuline au niveau de l’organisme.

Les taux d'insuline à jeun et lors du clamp sont également plus élevés dans le groupe nourri avec un régime riche en matières grasses, ce qui renforce la présence d'un phénotype de résistance à l'insuline. Chez ces souris, le glucose tritié est utilisé pour estimer la vitesse d'apparition endogène du glucose. Endo A constitue un indice de la production hépatique de glucose, tandis que l'insuline supprime complètement l'endo A chez les souris témoins.

La suppression est altérée chez les souris nourries avec un régime riche en graisses. De manière similaire, le glucose TRID est utilisé pour estimer la vitesse de disparition du glucose au niveau de l'organisme entier. Rd, la capacité de l'insuline à stimuler Rd est compromise chez les souris nourries avec un régime riche en graisses.

Le 2-désoxyglucose marqué au carbone 14 est utilisé pour évaluer l'indice métabolique du glucose RG, une mesure de la captation tissulaire spécifique du glucose. Comme le montre cet exemple, la captation de glucose stimulée par l'insuline dans le muscle squelettique est altérée chez les souris nourries avec un régime riche en graisses. En général, les personnes novices dans cette méthode éprouvent des difficultés avec la microchirurgie nécessaire à l'implantation des cathéters artériel et veineux.

La chirurgie exige des compétences très spécialisées et nécessite une pratique constante pendant plusieurs mois afin de maîtriser parfaitement la technique chirurgicale pour le clamp hyperinsulinémique euglycémique ; la difficulté réside une fois encore dans la tentative de maintenir une euglycémie chez un modèle animal présentant un métabolisme très élevé.