Imagerie de la dynamique subcellulaire du calcium dans les neurones de Caenorhabditis elegans

Prenez deux souches transgéniques distinctes de Caenorhabditis elegans sur des lames avec des tampons gélosés. Les coussinets contiennent une solution roulante avec un agent paralysant qui minimise les mouvements.

Le cordon nerveux ventral des vers, ou VNC, contient des interneurones excitateurs qui expriment des indicateurs de calcium cytoplasmique dans une souche et des indicateurs de calcium mitochondrial dans l’autre.

Placez une lamelle pour faire rouler les vers, en orientant le VNC pour la visualisation, puis positionnez-les sous un microscope à fluorescence.

Utilisez la lumière visible pour localiser les vers, puis passez en mode fluorescence.

Dans les neurones au repos, un faible taux de calcium intracellulaire maintient les indicateurs non liés, ce qui entraîne une faible fluorescence.

L’activité neuronale spontanée ouvre des canaux calciques voltage-dépendants, permettant l’afflux de calcium.

Dans la souche avec des indicateurs cytoplasmiques, le calcium se lie aux indicateurs, améliorant la fluorescence cytoplasmique.

L’excès de calcium cytoplasmique pénètre dans les mitochondries par les canaux. Dans la souche avec des indicateurs mitochondriaux, la liaison au calcium augmente la fluorescence mitochondriale.

Imagez les neurones des deux souches pour surveiller la dynamique subcellulaire du calcium.

Dans un tube de culture en verre de 13 x 100 millimètres, préparez 3 millilitres de gélose à 10 % en dissolvant la gélose de qualité moléculaire dans M9 et au micro-ondes pendant plusieurs secondes. Pour fabriquer les tampons de gélose, préparez d’abord deux lames en ajoutant deux couches de ruban de laboratoire. Placez ensuite une lame de microscope entre les deux lames. Coupez l’extrémité d’une pointe de pipette de 1 000 microlitres et utilisez-la pour pipeter une petite goutte de gélose au centre de la lamelle.

Aplatissez l’agar en appuyant sur une autre glissière sur le dessus de l’agar. Après refroidissement, coupez la gélose en un petit disque à l’aide de l’ouverture d’un tube de 10 millilitres, puis retirez la gélose environnante. Ensuite, préparez la solution de roulement de vis sans fin en dissolvant la poudre de muscimol dans M9 pour créer un stock de 30 millimolaires. Diluez le stock dans un rapport de un à un avec des billes de polystyrène pour obtenir la solution de roulement.

Pour positionner la vis sans fin pour l’imagerie, placez d’abord 1,6 microlitre de la solution roulante au centre du tampon gélosaire. Ensuite, à l’aide d’un cure-vis préféré, transférez un ver de l’âge souhaité dans la solution roulante sur le tampon gélosée. Attendez environ cinq minutes que le muscimol réduise le mouvement du ver, puis déposez une lamelle de 22 x 22 millimètres sur le dessus du tampon gélosaire.

Pour imager les neurites dans le cordon nerveux ventral, faites rouler le ver en faisant glisser légèrement la lamelle. Pour monter le ver sur le microscope, placez une goutte d’huile d’immersion sur la lamelle. Trouvez le ver à l’aide d’un objectif à faible grossissement en fond clair. Passez ensuite à l’objectif 100X et localisez le neurite AVA à l’aide de l’éclairage du GCaMP ou du mito-GCaMP avec le laser d’imagerie de 488 nanomètres.