Préparation de Synaptoneurosomes de Mouse Cortex en utilisant un gradient de densité discontinu de Percoll-sucrose

L’objectif global de cette procédure est de préparer un synap translationnellement actif vers les zones neuronales du cortex cérébral de la souris, en utilisant un gradient de densité de saccharose peral discontinu. Ceci est accompli en collectant et en homogénéisant d’abord les cortex de souris, puis en centrifugeant l’homogénat. Ensuite, appliquer l’homogénat de centrifugeuse, ou supnatant aux gradients de carbone par co-saccharose.

La dernière étape consiste à centrifuger et à collecter la fraction synaptosomale. En fin de compte, l’analyse par transfert Western et les expériences d’incorporation de la méthionine S 35 montrent que la fraction synaptosomique est enrichie syntaxiquement et active en traduction. Les principaux avantages de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que la centrifugation et la filtration, notre premier dommage mécanique est évité en utilisant des gradients de densité, et le second par appel a une faible toxicité envers les cellules dans leurs constituants.

En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal à s’adapter à ce protocole, car le timing joue un rôle clé. Une fois que les cortis ont été récoltés, la procédure doit être rapidement terminée. Pour commencer la procédure, préparez les couches de gradient de 3, 10, 15 et 23 % en ajoutant les quantités respectives de SIP comme décrit dans le manuscrit d’accompagnement à la mémoire tampon GM et mélangez bien.

Versez les couches dégradées en pipetant deux millilitres de chacune des solutions de pétrole isosmotique à 23 15, 10 et 3 % dans les tubes à centrifuger Beckman avec capuchons. À l’aide d’une pipette P 1000, l’interface entre les couches doit être clairement discernable, sans mélange des couches. Enregistrez les pentes de quatre degrés Celsius pendant au moins 20 minutes avant de l’utiliser.

Avant de commencer cette procédure, préparez d’autres solutions nécessaires comme décrit dans le manuscrit ci-joint. Euthanasiez la souris à l’âge de P 13 à P 21 et préparez-la pour la dissection en vaporisant l’arrière du cou et la tête avec de l’éthanol à 70 %. Ensuite, utilisez une paire de ciseaux tranchants pour couper la moelle épinière à la base du crâne.

Ensuite, retirez la peau du haut du crâne. Coupez le crâne latéralement entre l’os pariétal et l’os interpariétal, ou entre le cerveau et les régions du cortex. Après cela, coupez le crâne de la base au nez le long de la suture sagittale.

À cette étape, retirez soigneusement l’os pariétal mou en tirant chaque hémisphère sur le côté. Après cela, insérez la spatule dans le cerveau au-dessus du cervelet pour retirer le cortex. Placez-le dans un tampon GM glacé et répétez les procédures à nouveau pour collecter plus de cortex.

Rincez maintenant les cortex dans un tampon GM glacé. Transférez ensuite deux cortex dans un homogénéisateur en verre contenant cinq millilitres de tampon GM froid. Homogénéisez doucement les cortex avec cinq à 10 coups de pilon A, le pilon lâche suivi de cinq à 10 coups de pilon B, le type pilon.

Le nombre de coups varie en fonction de l’homogénéisateur individuel. Transférez l’homogénat dans un tube conique de 15 millilitres. Centrifugez-le à 1000 fois.

Gravité pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius dans une centrifugeuse Allegra six KR pour granuler les débris cellulaires et les noyaux. Superposez deux millilitres de supinate pour chaque gradient de per ou de saccharose avec un gradient pour chaque cortex entier et coiffez les tubes. Ensuite, centrifugez-les dans un rotor à angle fixe à 32, 500 fois la gravité pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius dans une centrifugeuse Beckman J 2 21.

À l’aide d’adaptateurs appropriés, une fois terminé, le gradient doit donner une pipette à bande SN puissante et jeter la solution au-dessus de la bande SN. À l’aide d’une pipette à pâtes en verre à partir de la bande SN à l’interface de 15 à 23 %, un gradient donne généralement environ 0,9 à 1,1 millilitre de sns. Après cela, transférez-le dans un tube conique et stockez-le sur de la glace.

Ajustez ensuite la concentration en sel du SNS en ajoutant un 10ème volume de 10 fois le tampon de stimulation. Ajouter éventuellement 1000 fois de chlorure de calcium pour obtenir une concentration finale de 12 molaires ano. Ensuite, ajoutez une crosse TTX millimolaire pour obtenir une concentration finale d’une micromolaire afin de supprimer l’excitation non spécifique.

L’étape suivante consiste à utiliser le SNS dans l’application en aval applicable, telle que les études de traduction des protéines. Pour d’autres applications, le lysat SN peut être nettoyé ou concentré à l’aide du kit de préparation d’échantillons de page SDS Pierce. La concentration en protéines du SNS peut être déterminée à l’aide du kit de dosage des protéines micro BCA.

Voici un exemple de six bandes ou fractions. Lorsque le cortex de la souris a été homogénéisé et séparé sur des gradients discontinus de perol saccharose, les SNS enrichis ont été contenus dans la bande cinq à l’interface de 23 à 15 %, cette bande a été retirée et examinée par microscopie électronique. Un exemple de vésicules synaptiques intactes et de préservation des éléments pré-synaptiques et post-synaptiques est montré ici dans le western blot.

Une augmentation des marqueurs synaptiques et une diminution des impuretés dans la bande SN à partir d’un gradient discontinu par saccharose confirment que l’augmentation de l’incorporation de la méthionine S 35 lors de l’ajout de glutamate est due à la synthèse protéique de novo. 40 mycine anesa micromolaire, un inhibiteur de la synthèse des protéines, a été ajouté. Cette figure montre la diminution marquée de l’incorporation de la méthionine S 35 en présence de mycine anso avec ou sans glutamate présent par rapport aux niveaux basaux.

Ainsi, les gradients discontinus de saccharose peral produisent rapidement des SNS très actifs et relativement purs qui peuvent être utilisés pour étudier la traduction des protéines. Cette figure montre que la bande cinq du gradient discontinu de saccharose par cœur contient les niveaux les plus élevés de synthèse protéique de novo. Il a été démontré que le SNS préparé en faisant passer le cortex homogénéisé à travers une série de filtres dont la taille des pores diminue, puis en centrifugeant sur un gradient discontinu de saccharose par cœur, à titre de comparaison, contient plus de membranes brisées et moins de SNS entiers que le SNS préparé à partir de la méthode de gradient de saccharose perol discontinu

Il a été démontré que les SNS préparés à partir de souris plus jeunes ont une plus grande activité translationnelle que les souris plus âgées. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne idée de la façon d’isoler les zones neuronales synaptiques actives en homogénéisant les cortex de souris en centrifugant l’homogénat dans un rotor à godets oscillants, en centrifugeant le surnageant sur un gradient de saccharose par appel dans un rotor à angle fixe, puis en collectant la bande de la zone neuronale synaptique résultante.