Name: Purification chromatographique des ribosomes de levure hautement active (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-24T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: Découvrez une méthode chromatographique rapide pour purifier des ribosomes de levure hautement actifs et intacts. Cette technique élimine les exonucléases et protéases contaminantes pour des analyses biochimiques fiables.

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Nous tenons à remercier tous les membres du laboratoire Dinman, y compris Ashton Belew, Karen Jack, Sharmishtha Musalga, Sergey Sulima, Shivani Reddy, et Michael Rhodin pour leur aide et leur participation à ce projet. Ce travail a été soutenu par des subventions à l&#39;AM de l&#39;American Heart Association (AHA 0630163N) et à partir du JDD National Institutes of Health (5R01 GM058859-12). JAL a été soutenue par un réinvestissement américains et Recovery Act de 2009 supplément à la subvention des parents (3R01GM058859-11S1).

1. Préparation d'une cystéine chargé Sulfolink de résine <ol><li> Préparer Sulfolink résine (Pierce) à température ambiante. </li><li> Placer un total de 10 ml d'une suspension de 50% de gel de couplage Sulfolink tel que fourni par le fabricant dans deux flacons de 10 ml en plastique, avec 5 ml distribué dans chaque flacon. </li><li> Centrifuger brièvement flacons à 850 xg et retirez soigneusement surnageants. </li><li> Lavez les trois gel de fois dans le tampon de couplage (50 mM Tris, pH 8,5, EDTA 5 mM) par remise en suspension des billes dans 5 ml, centrifuger brièvement à 850 xg et élimination du surnageant à la pipette. </li><li> Ajoutez cinq ml d'une solution 50 mM de L-cystéine dans le tampon de couplage à chaque tube et mélanger le lisier pendant 1 heure à 25 ° C. </li><li> Enlever le résidu L-cystéine par un lavage comme décrit dans l'étape 1.4 ci-dessus. </li><li> Reprendre le gel dans 10 ml de tampon de liaison [20 mM HEPES, pH 7,6, 5 mM de Mg (OAc) 2, 60 mM de NH 4 Cl, 2 mM DTT], et équilibrer la résine par lavage dans 10 ml de tampon de liaison3 fois comme décrit dans l'étape 1.4. Décanter la résine dans une colonne de 10 ml par centrifugation, casquette et conservés à 4 ° C. La capacité de la résine pour la liaison à l'ARN est ~ 20 A 260 unités par ml. </li></ol> 2. Purification chromatographique des ribosomes en utilisant une cystéine chargé Sulfolink de résine Remarque: Si vous travaillez avec une souche où l'activité de la protéase se révèle être un problème, cocktails inhibition des protéases peut être utilisé dans tous les tampons suivants. <ol><li> Maintenir tous les composants sur la glace et préparer toutes les solutions utilisant l'eau sans RNase et la filtration stérile. </li><li> Cultivez les cellules de levure nuit à la mi-phase log (DO 595 = 0,6 - 1,2) dans les médias appropriés. Cellules par centrifugation, et laver les cellules 1 gramme dans le tampon de liaison et centrifuger à 3700 xg pendant 5 minutes à 4 ° C. </li><li> Resuspendre les cellules dans 1 ml de tampon de liaison à un volume total approximatif de 2 ml, et de perturber l'aide d'un volume égal à 0,5 mm de perles de verre réfrigéré à 4 ° C uchanter une Biospec Mini-perles batteur (Bartlesville, OK). Les échantillons peuvent être divisés en plusieurs tubes, au besoin. </li><li> Retirer les cellules ininterrompue, les organites, et les débris cellulaires par centrifugation à 30000 xg pendant 30 minutes dans une ultracentrifugeuse Beckman-Coulter Optima Max E (Fullerton, CA). </li><li> Immédiatement avant utilisation, granulés de la résine pendant une minute à 1000 xg pour éliminer la solution de stockage. Deux ml de résine est utilisée pour chaque gramme de cellules. </li><li> Retirer surnageants lysat cellulaire de la vrille 30000 xg (S30), en prenant soin de minimiser la contamination soit de la fraction lipidique au sommet ou les débris cellulaires au fond des tubes, et placer directement dans la boue Sulfolink facturés. La couche lipidique peut être évité soit par enlèvement ou en poussant à partir de la pipette, après la pointe a traversé dans le surnageant. </li><li> Incuber le mélange S30/Sulfolink sur la glace sans mélanger pendant 15 minutes. </li><li> Placer les colonnes dans 15 ml tubes coniques et centrifuger à 1000 xg pendantr une minute. </li><li> Placer les fractions accréditives retour dans les colonnes, mélanger à la main, et incuber pendant encore 15 minutes sur la glace. </li><li> Placer les colonnes dans 15 ml tubes coniques et centrifuger à 1000 xg pendant une minute. Jeter les actions accréditives. </li><li> Cap colonnes et ajouter 5 ml de tampon de liaison. Mélanger à la main jusqu'à colonnes resuspendues, enlever les bouchons et centrifuger la centrifugeuse colonnes à 1000 xg pendant une minute. Répétez ce protocole de lavage deux fois plus. </li><li> Ajouter 1,5 ml de tampon d'élution (20 mM HEPES-KOH, pH 7,6, 10 mM Mg (OAc) 2, 500 mM de KCl, 2 mM de DTT, 0,5 mg / ml d'héparine) pour chaque colonne. Mélanger boues à la main, et incuber sur glace pendant 2 minutes </li><li> Placer les colonnes dans de nouveaux tubes coniques de 15 ml et centrifuger à 1000 xg pendant 1 minute. Recueillir l'éluat. Répétez l'étape d'élution fois de plus pour que les derniers volumes de l'échantillon combiné sont ~ 3 ml. Résine utilisée peut être lavée avec un tampon d'élution sans héparine et suivie par équilibration avec Buffe contraignanter, et stockés dans 10 volumes ml de tampon de liaison à 4 ° C pour les réutiliser plus tard. </li></ol> 3. Traitement de puromycine Note: Une méthode alternative pour enlever la contamination des espèces ARNt est de passer d'un glucose riche pour les médias afin de promouvoir le glucose appauvri les eaux de ruissellement des ribosomes. Toutefois, cela ne change l'état métabolique des cellules de levure, ce qui pourrait affecter la fonction du ribosome et la concentration. Pour dépouiller les ribosomes endogènes du peptidyl-ARNt, un traitement avec puromycine est effectuée. <ol><li> Neutraliser à pH 7,5 100 mM solution de puromycine en ajoutant goutte à goutte de KOH 1M à température ambiante. </li><li> Ajouter la solution neutralisée à la puromycine ~ 1 mM concentration finale dans l'éluat. </li><li> Ajouter 100 mM GTP à une concentration finale de 1 mM. </li><li> Incuber pendant 30 minutes à 30 ° C. </li></ol> 4. Purification des ribosomes par sédimentation grâce à des coussins de glycérol <ol><li> Placer un mlde tampon coussin (20 mM HEPES, pH 7,6, 10 mM Mg (OAc) 2, 500 mM de KCl, 2 mM de DTT, glycérol 25%) dans un tube de 4 volumes ultracentrifugeuse ml en polycarbonate. </li><li> Délicatement la couche puromycine traités fractions d'élution sur le dessus du coussin, et des échantillons de centrifugation à 100.000 xg nuit à 4 ° C. </li><li> Retirer les tubes de l'rotor de la centrifugeuse, et aspirer surnageants. </li><li> Laver des pastilles contenant des ribosomes purifié deux fois avec 1 ml de tampon de coussin. </li><li> Resuspendre ribosomes dans 100 ul de tampon coussin par des perturbations douces en utilisant une tige de verre. </li><li> Après les perturbations, couvrir les tubes avec du parafilm et agiter à une vitesse modérée dans un tourbillon chambre froide pendant une heure. </li><li> Transférer le contenu dans un tube à centrifuger, centrifuger pendant 5 minutes à vitesse maximale à 4 ° C, et de supprimer les surnageants dans des tubes frais. </li><li> Répétez les étapes 04/01 au 04/07 avec 2 ml de tampon coussin et, sauf que ul 100 de stockage tampon (50 mM HEPES-KOH pH 7,6, 50 mM de NH 4 Cl, 5 mM de Mg(OAc) 2, DTT 1 mM, glycérol 25%) est utilisé dans les étapes 4.4 et 4.5 au lieu de tampon coussin. </li><li> Quantifier les ribosomes purifiée par spectrophotométrie (1 A 260 = 20 pmoles de ribosomes de levure), et conserver à -80 ° C. Les résultats typiques d'1 gramme de levure sont de 300 à 400 pmoles de ribosomes. </li></ol> 5. Les résultats représentatifs: Un exemple d'espèces d'ARN extrait de chacune des trois grandes étapes de ce protocole est montré dans la figure 2. Alors que les ARNr sont les principales espèces présentes dans les lysats cellulaires totaux (T), ces contiennent également un grand nombre d'espèces d'ARN d'autres. Les ribosomes purifiée à partir de la colonne Sulfolink (SL) contiennent également une grande quantité d'ARNt en raison de la forte affinité du lit de la colonne pour ces espèces ainsi. Le traitement de cette fraction avec des résultats puromycine dans l'hydrolyse des peptides issus de la peptidyl-ARNt, et favorise la dissociation de ces espèces de ribosomes. La puromycine échantillons traités (Pm) l'absence de co-purifying espèces ARNt, et représentent donc des ribosomes complètement pur. Comme indiqué précédemment 8, ces ribosomes sont très intact et biochimiquement active, ce qui les rend idéales pour les substrats détaillée des analyses fonctionnelles et structurelles. <img src="/files/ftp_upload/3214/3214fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Organigramme méthode. Purification chromatographique des ribosomes utilisant la cystéine liée sulfolink résine est représenté. <img src="/files/ftp_upload/3214/3214fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Représentant l'analyse des préparations ribosome. Espèces d'ARN total ont été extraites à partir de lysats cellulaires totaux (T), Sulfolink ribosomes purifié (SL) et purifiée ribosomes Sulfolink ensuite traité par la puromycine et sédimenté à travers un coussin de glycérol (Pm). Lane M représente la taille des marqueurs ARN. Bandes représentant ARNr 25S et 18S, ainsi que les ARNt et d'autres espèces d'ARN sont indiqués. Tous lesvoies ont été chargées avec 2 ug d'ARN.

<ol><li>Palade, G. E., Siekevitz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+microsomes%3B+an+integrated+morphological+and+biochemical+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biophys.+Biochem.+Cytol%22%5BJournal%5D)">Liver microsomes; an integrated morphological and biochemical study.</a> J. Biophys. Biochem. Cytol. 2, 171-200 (1956).</li>
<li>Fabry, M., Kalvoda, L., Rychlik, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrophobic+interactions+of+Escherichia+coli+ribosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Hydrophobic interactions of Escherichia coli ribosomes.</a> Biochim. Biophys. Acta. 652, 139-150 (1981).</li>
<li>Jelenc, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+purification+of+highly+active+ribosomes+from+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Rapid purification of highly active ribosomes from Escherichia coli.</a> Anal. Biochem. 105, 369-374 (1980).</li>
<li>Le goffic, F., Moreau, N., Chevelot, L., Langrene, S., Siegrist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+bacterial+ribosomes+using+chloramphenicol+and+erythromycin+columns%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Purification of bacterial ribosomes using chloramphenicol and erythromycin columns.</a> Biochimie. 62, 69-77 (1980).</li>
<li>Meskauskas, A., Petrov, A. N., Dinman, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+functionally+important+amino+acids+of+ribosomal+protein+L3+by+saturation+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification of functionally important amino acids of ribosomal protein L3 by saturation mutagenesis.</a> Mol. Cell Biol. 25, 10863-10874 (2005).</li>
<li>Algire, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+characterization+of+a+reconstituted+yeast+translation+initiation+system%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Development and characterization of a reconstituted yeast translation initiation system.</a> RNA. 8, 382-397 (2002).</li>
<li>Maguire, B. A., Wondrack, L. M., Contillo, L. G., Xu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+chromatography+system+to+isolate+active+ribosomes+from+pathogenic+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">A novel chromatography system to isolate active ribosomes from pathogenic bacteria.</a> RNA. 14, 188-195 (2008).</li>
<li>Leshin, J. A., Rakauskaite, R., Dinman, J. D., Meskauskas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+purity%2C+activity+and+structural+integrity+of+yeast+ribosomes+purified+using+a+general+chromatographic+method%5BTitle%5D)+AND+%22RNA.+Biol%22%5BJournal%5D)">Enhanced purity, activity and structural integrity of yeast ribosomes purified using a general chromatographic method.</a> RNA. Biol. 7, 354-360 (2010).</li>
<li>Triana, F., Nierhaus, K. H., Chakraburtty, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+RNA+binding+to+80S+ribosomes+from+yeast%3A+evidence+for+three+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Mol.+Biol.+Int%22%5BJournal%5D)">Transfer RNA binding to 80S ribosomes from yeast: evidence for three sites.</a> Biochem. Mol. Biol. Int. 33, 909-915 (1994).</li>
<li>Azzam, M. E., Algranati, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+puromycin+action%3A+fate+of+ribosomes+after+release+of+nascent+protein+chains+from+polysomes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Mechanism of puromycin action: fate of ribosomes after release of nascent protein chains from polysomes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 70, 3866-3869 (1973).</li>
<li>Nathans, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Puromuycin+inhibition+of+protein+synthesis%3A+incorporation+of+puromycin+into+peptide+chains%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Puromuycin inhibition of protein synthesis: incorporation of puromycin into peptide chains.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 51, 585-592 (1964).</li>
<li>Rabinovitz, M., Fisher, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dissociative+effect+of+puromycin+on+the+pathway+of+protein+synthesis+by+Ehrlich+ascites+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A dissociative effect of puromycin on the pathway of protein synthesis by Ehrlich ascites tumor cells.</a> J. Biol. Chem. 237, 477-481 (1962).</li>
<li>Allen, D. W., Zamecnik, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+puromycin+on+rabbit+reticulocyte+ribosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">The effect of puromycin on rabbit reticulocyte ribosomes.</a> Biochim. Biophys. Acta. 55, 865-874 (1962).</li>
<li>Yarmolinsky, M. B., Haba, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+by+puromycin+of+amino+acid+incorporation+into+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Inhibition by puromycin of amino acid incorporation into protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 45, 1721-1729 (1959).</li>
<li>Becker-Ursic, D., Davies, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+and+in+vitro+phosphorylation+of+ribosomal+proteins+by+protein+kinases+from+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">In vivo and in vitro phosphorylation of ribosomal proteins by protein kinases from Saccharomyces cerevisiae.</a> Biochemistry. 15, 2289-2296 (1976).</li>
</ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

Protocoles de purification ribosome essentiellement impliquent lyse des cellules, la récolte d&#39;une fraction cytosolique d&#39;une vrille à basse vitesse, puis granulation ribosomes par centrifugation à grande vitesse 1. Bien qu&#39;un peu de nouvelles méthodes ont été utilisées pour la purification de ribosomes bactériens, le même n&#39;avait pas été vrai pour les eucaryotes 2-4. Bien que des mesures supplémentaires ont été ajoutés au fil des années, se lave le sel par exemple, et les coussins ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Société </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> Sulfolink Couplage de résine </td><td> Pierce </td><td> 20402 </td></tr><tr><td> Mini-batteur billes 16 </td><td> Biospec </td><td> 607 </td></tr><tr><td> Optima Max E ultracentrifugeuse </td><td> Beckman Coulter </td><td></td></tr><tr><td> Légende RT </td><td> Sorvall </td><td></td></tr><tr><td> 0,5 mm Perles de verre </td><td> Biospec </td><td> 11079105 </td></tr><tr><td> Tris </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 252859 </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E9884 </td></tr><tr><td> TNT </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 43815 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 54459 </td></tr><tr><td> NH 4 Cl </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A9434 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 60128 </td></tr><tr><td> Mg (OAc) 2 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M5661 </td></tr><tr><td> KOH </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 221473 </td></tr><tr><td> Glycérol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G5516 </td></tr><tr><td> Puromycine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P7255 </td></tr><tr><td> GTP </td><td> Fermentas </td><td> R0461 </td></tr></tbody></table>

purification chromatographique des ribosomes de levure hautement active

Chromatographic Purification of Highly Active Yeast Ribosomes

Ribosomes eucaryotes sont beaucoup plus labiles par rapport à leurs homologues eubactériennes et archael, posant ainsi un défi important pour les chercheurs. Particulièrement gênant est le fait que la lyse des cellules libère un grand nombre de protéases et nucléases qui peut dégrader les ribosomes. Ainsi, il est important de séparer les ribosomes de ces enzymes aussi rapidement que possible. Malheureusement, les méthodes classiques ultracentrifugation différentielle feuilles ribosomes exposés à ces enzymes pour des périodes trop longues de temps, des répercussions sur leur intégrité structurelle et la fonctionnalité. Pour résoudre ce problème, nous utilisons une méthode chromatographique en utilisant une cystéine chargé Sulfolink résine. Cette application simple et rapide réduit considérablement la co-purifiant activités protéolytiques et nucléolytique, produisant des rendements élevés intacte, les ribosomes levure hautement biochimiquement active. Nous suggérons que cette méthode devrait également être applicable aux ribosomes de mammifères. La simplicité dela méthode, et la pureté améliorée et l&#39;activité des ribosomes purifié par Chromatographie représente un progrès technique important pour l&#39;étude des ribosomes eucaryotes.

La contamination des préparations de ribosomes eucaryotes purifié par les méthodes traditionnelles par les co-purifiant nucléases et protéases une incidence négative sur l&#39;aval des analyses biochimiques et structurelles. Une méthode de purification chromatographique rapide et simple est utilisée pour résoudre ce problème en utilisant des ribosomes levure comme système modèle.

Purification chromatographique des ribosomes de levure hautement active

Les ribosomes eucaryotes sont beaucoup plus labiles que leurs homologues eubactériens et archéens, ce qui représente un défi important pour les chercheurs. ...

L'objectif général de cette procédure est de purifier des ribosomes de levure intacts et hautement actifs. Pour ce faire, on commence par lyser les cellules, puis on clarifie le lysat par centrifugation à haute vitesse. Pour obtenir la fraction S 30, on utilise ensuite une colonne liante SFO chargée en cystéine afin de purifier les ribosomes.Cela est suivi par l'élimination des ARNt contaminants à l'aide d'un traitement à la puromycine, qui constitue une étape finale de purification. Les ribosomes sont soumis à une ultracentrifugation à grande vitesse. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme la purification par ultracentrifugation, est que l'utilisation de la colonne SulfaLink permet de séparer rapidement les ribosomes des exonucléases et des protéases contaminants.En outre, l'étape de traitement par la puromycine sépare les ribosomes des espèces d'ARN contaminants telles que les ARNt. Ces étapes garantissent la production de rendements élevés de ribosomes purifiés, intacts et hautement actifs, destinés à des études biochimiques et structurales. La démonstration de la procédure sera assurée par Jonathan Leschen, chercheur postdoctoral associé de mon laboratoire.Commencez ce protocole en pipetant une suspension à 50 % de gel de sulfa link pour couplage, fournie par le fabricant, dans deux vials en plastique de 10 millilitres, avec cinq millilitres répartis dans chaque vial. Après une courte centrifugation des vials à 850 ×g, retirez soigneusement les surnageants. Lavez le gel trois fois dans le tampon de couplage par resuspension, en suspendant les billes dans cinq millilitres, puis en centrifugeant brièvement à 850 ×g. Retirez le surnageant à l’aide d’une pipette. Après lavage de la résine, ajoutez cinq millilitres d’une solution de L-cystéine à 50 millimolaire dans le tampon de couplage dans chaque tube.Mélangez la suspension pendant une heure à 25 degrés Celsius. Ensuite, éliminez la L-cystéine résiduelle en lavant la résine trois fois avec du tampon de couplage seul. Puis, resuspendez le gel dans 10 millilitres de tampon de liaison et équilibrez la résine en la lavant trois fois.Enfin, versez délicatement la résine dans une colonne de centrifugation de 10 millilitres et fermez-la avec un bouchon. La résine peut être conservée à quatre degrés Celsius et possède une capacité d'environ 20 à 60 unités par millilitre lors de la purification chromatographique des ribosomes, en utilisant une résine sulfa lien chargée en cystine.Conserver tous les composants sur de la glace et préparer toutes les solutions à l’aide d’eau exempte d’ARN et de filtration stérile. Faire croître les cellules de levure toute la nuit jusqu’à la phase exponentielle intermédiaire dans le milieu approprié. Après avoir pelleté les cellules par centrifugation, laver un gramme de cellules dans du tampon de liaison et centrifuger à nouveau, puis resuspendre les cellules dans un millilitre de tampon de liaison pour un volume total approximatif de deux millilitres.Disruptez les cellules en utilisant un volume égal de billes de verre de 0,5 millimètre refroidies à quatre degrés Celsius, ainsi qu’un broyeur à billes miniaturisé. Éliminez les cellules non lysées, les organites et les débris cellulaires par centrifugation à 30 000 × g pendant 30 minutes dans une ultracentrifugeuse. Pendant ce temps, faites précipiter la résine par une centrifugation d’une minute à 1000 × g. Éliminez la solution de conservation immédiatement avant utilisation.Deux millilitres de résine sont utilisés pour chaque gramme de cellules. Après ultracentrifugation des échantillons, retirez les surnageants de lyse cellulaire du dépôt à 30 000 fois G, appelé S 30. Veillez à minimiser toute contamination par la fraction lipidique située tout en haut ou par les débris cellulaires au fond des tubes.Transférez directement les surnageants dans la suspension chargée de SFO link. Incubez le mélange S 30 SFO link sur de la glace pendant 15 minutes. Placez les colonnes dans des tubes coniques de 50 millilitres et centrifugez à 1000 ×g pendant une minute, transférez les fractions de passage directement dans les colonnes, fermez les colonnes et retournez-les pour homogénéiser.Incuber les échantillons pendant encore 15 minutes sur de la glace. Ensuite, placer les colonnes dans des tubes coniques de 50 millilitres et centrifuger à 1000 ×g pendant une minute, puis jeter le flux sortant. Après avoir ajouté cinq millilitres de tampon de liaison, boucher les colonnes et les retourner pour mélanger jusqu'à complète resuspension.Retirez les bouchons et centrifugez les colonnes à 1000 fois G pendant une minute. Répétez ce protocole de lavage deux fois supplémentaires. Ensuite, ajoutez 1,5 millilitre de tampon d’élution à chaque colonne.Mélangez les suspensions manuellement et incubez sur de la glace pendant deux minutes. Dans la dernière étape, placez les colonnes dans de nouveaux tubes coniques de 50 millilitres et centrifugez à 1000 ×g pendant une minute. Récupérez l’éluate et répétez l’étape d’élution une fois de plus afin que le volume final combiné des échantillons soit d’environ trois millilitres. Afin de dissocier les ribosomes de la peptol endogène, un traitement par ARNt-T et la purmycine est effectué.Tout d'abord, neutralisez une solution de pur mycine à 100 millimolaire en ajustant le pH à 7,5 par addition goutte à goutte d'hydroxyde de potassium à 1 molaire. Ajoutez à température ambiante. Ajoutez la solution de pur mycine neutralisée à une concentration finale d'environ un millimolaire dans l'éluate.Ensuite, ajoutez du GTP à 100 millimolaire pour obtenir une concentration finale de un millimolaire. Incubez le mélange pendant 30 minutes à 30 degrés Celsius. Après l'incubation, placez un millilitre de tampon de coussin dans un tube d'ultracentrifugation en polycarbonate de volume quatre millilitres.Déposer délicatement les fractions d'élution traitées à la purgamine sur le coussin et centrifuger les échantillons à 100 000 ×g pendant toute la nuit. Après avoir aspiré les surnageants, laver les culots contenant les ribosomes purifiés avec un millilitre de tampon de coussin. Répéter ce lavage avec un deuxième millilitre de tampon de coussin.Ensuite, Reza a resuspendu les ribosomes dans 100 microlitres de tampon de coussin par une dislocation douce à l’aide d’une tige en verre. Puis, couvrez les tubes avec du parafilm et agitez-les à vitesse modérée dans un vortex en chambre froide. Après une heure d’agitation, transférez le contenu dans un tube de microcentrifugeuse et centrifugez pendant cinq minutes à vitesse maximale à quatre degrés Celsius.Transférez les surnageants dans des tubes frais. Déposez les surnageants au-dessus de deux millilitres de tampon de coussin dans un tube d'ultracentrifugation, puis centrifugez à 100 000 × g pendant la nuit. Le lendemain, retirez les tubes du rotor de la centrifugeuse et aspirez les surnageants.En utilisant la méthode décrite ci-dessus, lavez les culots et remettez en suspension les ribosomes avec le tampon de stockage. Enfin, quantifiez les ribosomes purifiés par spectrophotométrie avant de les conserver à moins 80 degrés Celsius.Voici un exemple d'espèces d'ARN extraites à partir des trois étapes principales du protocole, y compris les lysats cellulaires totaux, les ribosomes purifiés par sulf olink, et les ribosomes purifiés par sufu link ensuite traités au pur mycine et sédimentés à travers un coussin de glycérol. Des marqueurs de taille d'ARN sont également présentés, tandis que nos ARN correspondent aux espèces majoritaires présentes dans les lysats cellulaires totaux. Ceux-ci contiennent également un grand nombre d'autres espèces d'ARN.Les ribosomes purifiés à partir de la colonne sulfa link contiennent une grande quantité d'ARNt en raison de l'affinité élevée du lit de colonne pour ces espèces. Le traitement de cette fraction avec la piro mycine entraîne l'hydrolyse des peptides à partir des ARNt peptidylés et favorise la dissociation de ces espèces des ribosomes. Les échantillons traités à la pure mycine ne présentent pas d'espèces d'ARNt co-purifiées et représentent donc des ribosomes complètement purs.Comme mentionné précédemment, ces ribosomes sont très intacts et biochimiquement actifs, ce qui en fait des substrats idéaux pour des analyses fonctionnelles et structurales détaillées. Après cette procédure, d'autres méthodes, telles que des tests permettant de surveiller la liaison de ligands aux ribosomes et des analyses structurales, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme : quelles sont les propriétés biochimiques et biophysiques des ribosomes eucaryotes ?

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Purification des mitochondries de cellules de levure

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Fixation et isolement rapides in vivo de complexes translationnels à partir de cellules eucaryotes

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