TRANSFERT DE GÈNES ASSISTÉ PAR ÉLECTROPORATION INCORPORÉ DANS L’AGAROSE DANS DES PROGÉNITEURS D’INTERNEURONES CORTICAUX DE SOURIS

Remplissez une micropipette avec un mélange d’ADN contenant des vecteurs plasmidiques porteurs du gène d’intérêt et un colorant de suivi. Fixez-le dans un micromanipulateur.

Placez un bloc d’agarose sous le microscope et placez une tranche de cerveau embryonnaire de souris incrustée d’agarose avec des interneurones corticaux dessus.

Abaissez la micropipette et injectez le mélange d’ADN dans la région progénitrice de l’interneurone. Le colorant de suivi marque le site d’injection.

Positionnez un autre bloc d’agarose sur une électrode de boîte de Pétri et une colonne d’agarose sur l’électrode de couverture.

Transférez la tranche sur le bloc et alignez l’électrode du couvercle sur le site d’injection.

Appliquez de brèves impulsions électriques pour perméabiliser temporairement les membranes cellulaires, permettant aux plasmides de pénétrer dans le noyau.

Incuber la tranche dans un milieu pour maintenir la viabilité cellulaire.

À l’intérieur du noyau, le plasmide déclenche l’expression des gènes, produit la protéine cible et module les fonctions progénitrices de l’interneurone.

Pour l’injection, mélanger l’ADN du vecteur d’expression et de contrôle à une concentration de 1 microgramme par microlitre pour chaque vecteur, et ajouter une solution verte rapide à une dilution de 1 à 10e. Remplissez une micropipette en verre de 0,5 millimètre de diamètre intérieur et de 1 millimètre de diamètre extérieur avec 10 microlitres du mélange d’ADN, et chargez la micropipette dans un injecteur de pico pompe pneumatique. Placez le plus gros bloc d’agarose sous un stéréomicroscope et placez la tranche à injecter sur le morceau d’agarose.

Ensuite, injectez 25 à 50 volumes nanolitres dans la région d’éminence ganglionnaire médiale ou caudale sélectionnée de la tranche. Immédiatement après l’injection, placez le petit bloc d’agarose sur l’électrode de la boîte de Pétri et utilisez une microspatule à extrémité plate pour fixer la colonne d’agarose à l’électrode de couverture mobile.

Transférez la tranche injectée avec sa membrane de support sur le bloc d’agarose et placez l’électrode supérieure avec la colonne d’agarose au-dessus de la région sélectionnée de la tranche. Ensuite, galvanisez la région avec deux impulsions de 5 millisecondes de 125 volts, à 500 millisecondes d’intervalle. Après l’électroporation, remettez la tranche avec sa membrane de support dans sa boîte de maintien et remettez la boîte dans l’incubateur de culture tissulaire.