Développement d'une manière unilatérale-lésés 6-OHDA modèle murin de la maladie de Parkinson

L'objectif général de cette procédure est de générer un modèle murin de parkinsonisme. Cela est réalisé en préparant d'abord les médicaments nécessaires à la chirurgie. L'étape suivante consiste à installer l'appareillage chirurgical, puis à réaliser une lésion unilatérale par la 6-hydroxydopamine, suivie de soins postopératoires appropriés.

Les animaux lésés par la six-hydroxydopamine peuvent être utilisés pour des expériences comportementales. En définitive, les résultats montrent une déplétion de la dopamine supérieure à 95 % dans le faisceau médial des quatre nerfs cérébraux, d’un seul côté. Les deux aspects les plus importants de cette procédure auxquels les individus doivent prêter attention sont, premièrement, des soins postopératoires appropriés afin d'assurer la survie des animaux.

Deuxièmement, préparer soigneusement le matériel pour l'infusion de l'hydroxydopamine afin de garantir une administration complète de la neurotoxine. Pour commencer cette procédure, stériliser les instruments chirurgicaux dans un autoclave. Ensuite, nettoyer toutes les surfaces et le matériel avec de l'alcool isopropylique.

Préparez ensuite le poste chirurgical en installant une cage de récupération pour souris avec des essuie-tout sur la base. Placez la cage sous une lampe chauffante ou sur un tapis chauffant afin d'aménager le chariot d'anesthésie. Assurez-vous que l'arrivée d'oxygène est connectée et ouverte, et que le réservoir d'isoflurane est complètement rempli.

Après cela, régler le débit d'oxygène à 1 % et l'isoflurane à 2 à 4 %. La prochaine étape consiste à assembler l'appareil d'infusion. Enfiler un écrou métallique RN sur un côté du tube peak, suivi par le cône peak feral. Ensuite, le feral PFA canonique, orienter les ferals de manière que le cône du feral PPFA canonique s'insère dans la pièce d'assemblage du cône peak feral.

Ensuite, insérez le raccord conique mâle et le fût canonic PFA dans chaque extrémité du raccord RN à double emboîtement étroit, puis serrez l'écrou métallique RN à l'autre extrémité du raccord RN à double emboîtement étroit. Insérez une aiguille d'injection de calibre 33. Faites passer l'aiguille à travers l'un des écrous métalliques RN et serrez-la.

Veillez à ce que l'aiguille de calibre 33 forme un angle de 180 degrés avec le raccord RN à double embase. Ensuite, à l'autre extrémité du tube peak, vissez un des écrous métalliques RN, suivi d'un embout peak femelle. Puis insérez le tube PFA femelle dans la rainure plus profonde du second raccord RN à double embase et serrez l'écrou métallique RN afin de fixer la connexion.

Ensuite, à l'autre extrémité du deuxième coupleur de petit hub RN double, insérez l'appât dans l'adaptateur de petit hub RN et serrez l'écrou métallique RN de l'appât afin de sécuriser la connexion. La mise en place de l'appareil d'infusion est désormais terminée. Une autre étape préparatoire consiste à amorcer l'appareil d'infusion.

Remplissez d'abord les seringues Hamilton de 250 microlitres et de un microlitre avec de l'eau stérile. Veillez à ce qu'il n'y ait aucune bulle d'air. Ensuite, fixez la seringue de 250 microlitres à l'adaptateur d'appât et abaissez le piston de la seringue de 250 microlitres afin que l'eau soit expulsée par l'aiguille d'injection de calibre 33 située à l'autre extrémité du tube.

Continuer à faire passer l'eau à travers le système tout en retirant la seringue de 250 microlitres de l'adaptateur d'appât. En laissant une petite goutte d'eau à l'extrémité de l'adaptateur d'appât, appuyer sur le piston de la seringue d'un microlitre jusqu'à ce qu'une petite goutte d'eau soit expulsée. Ensuite, insérer soigneusement la seringue d'un microlitre dans l'adaptateur d'appât.

Veillez à ce que la goutte d'eau sur la seringue d'un microlitre entre en contact avec la goutte d'eau sur l'adaptateur d'appât. Insérez ensuite complètement la seringue d'un microlitre dans l'adaptateur d'appât et assurez-vous qu'il n'y ait aucune bulle dans le petit raccord double RN. Fixez maintenant l'appareil de perfusion sur le cadre stéréotaxique et serrez le petit raccord double RN muni de l'aiguille d'injection de calibre 33 dans la pince de la pompe d'infusion sur le bras manipulateur du cadre stéréotaxique.

Ensuite, fixez la seringue d'un microlitre à la pompe de perfusion. Programmez ensuite la pompe d'infusion afin d'obtenir un débit d'infusion de 0,1 microlitre par minute, 30 minutes avant l'opération. Pesez l'animal et notez son poids.

Administrer un mélange de 2,5 milligrammes par millilitre de chlorhydrate de dopamine et de 0,5 milligramme par millilitre de chlorhydrate de parline à raison de 10 millilitres par kilogramme par injection intrapéritonéale à la souris. Ensuite, placer un disque chauffant sous les barres auriculaires et la barre incisive afin de maintenir la température de l'animal pendant la chirurgie et positionner l'animal à une hauteur idéale pour adapter les barres auriculaires et incisives du stéréotaxique. Encadrer 15 minutes après l'injection du mélange de chlorhydrate de dopamine et de chlorhydrate de parline.

Placer la souris dans une chambre fermée et une chambre de saisie. Anesthésier l'animal par inhalation d'isoflurane. L'animal est suffisamment anesthésié lorsqu'il ne présente aucune réaction à une pincée de la patte arrière et aucun réflexe palpébral.

Ensuite, raser le sommet de la tête de la souris. À ce stade, placer la souris dans le cadre stéréotaxique. Placer la barre incisive dans sa bouche et un masque d'anesthésie sur son visage.

Ensuite, ajustez le débit du fluorure d'isoflurane. Appliquez l'analgésique topique lidocaïne directement sur la peau à l'aide d'un coton. Réglez la barre incisive et les embouts auriculaires afin de niveler le sommet du crâne.

Ensuite, stérilisez la peau avec une solution de Bétadine. Puis, insérez les embouts auriculaires. Les embouts auriculaires sont correctement insérés lorsque la tête est parfaitement plate et ne peut pas être déplacée dans un sens ou dans l'autre.

Ensuite, incisez le long de la ligne médiane de la tête à l’aide d’une lame de scalpel et écartez la peau. Séchez la surface du crâne à l’aide d’un tampon de gaze. Enfoncez le piston de la seringue d’un microlitre et insérez l’aiguille d’injection de calibre 33 dans le tube d’un millilitre contenant 15 milligrammes par millilitre.

Solution de six hydroxydopamine recouverte de papier d’aluminium. Ramener lentement le piston en arrière tout en maintenant l’aiguille d’injection de calibre 33 immergée dans la solution de six hydroxydopamine. Ensuite, avancer l’extrémité de l’aiguille d’injection vers le B bgma, puis délivrer une petite quantité de solution de six hydroxydopamine afin de former une petite goutte.

Abaissez ensuite lentement la pointe de l'aiguille d'injection vers le foramen de Monro. Lorsque la perle touche le bgma, arrêtez d'avancer l'aiguille et enregistrez ces coordonnées. Rétirez l'aiguille d'injection de deux millimètres en direction dorsale et déplacez-vous le long de la suture sagittale dans une direction rostrale vers Lambda.

Lorsqu'il est au-dessus de Lambda, délivrez une petite quantité de solution de six hydroxydopamine à partir de l'aiguille d'injection pour former une petite goutte. Abaissez ensuite lentement la pointe de l'aiguille vers Lambda. Lorsque la goutte touche Lambda, arrêtez d'avancer l'aiguille et enregistrez ces coordonnées.

Les coordonnées médio-latérales et dorso-ventrales doivent être identiques pour le BMA et le Lambda. Si ce n'est pas le cas, ajustez la barre incisive en conséquence. Pour les coordonnées antéro-postérieures et les barres auriculaires concernant les coordonnées médio-latérales, déplacez l'aiguille jusqu'aux coordonnées d'injection.

AP moins 1,2 millimètres ml moins 1,1 millimètres par rapport au repère, délivrer une petite quantité de solution à partir de l'aiguille d'injection afin de former une petite goutte. Abaisser la petite goutte sur le crâne pour marquer l'emplacement où sera percé le trou. Ensuite, retirer l'aiguille et percer un trou dans le crâne à l'aide d'une aiguille de calibre 25.

Replacer l'aiguille d'injection aux coordonnées d'injection et insérer l'aiguille à moins cinq millimètres selon la direction dorso-ventrale. Ensuite, injecter 0,2 microlitre de six-hydroxydopamine ou de véhicule de manière unilatérale dans le faisceau médian du cerveau antérieur à un débit de 0,1 microlitre par minute. Une fois l'administration de la six-hydroxydopamine ou du véhicule terminée, laisser l'aiguille en place pendant cinq minutes supplémentaires afin de permettre la diffusion à partir du site d'injection.

Ensuite, retirez lentement l'aiguille, refermez l'incision du cuir chevelu à l'aide de trois points de suture, puis administrez un millilitre de solution de Ringer lactatée par voie sous-cutanée. Enfin, retirez l'animal du cadre stéréotaxique et placez-le dans la cage de récupération jusqu'à ce que la conscience soit retrouvée. Quinze à vingt et un jours après la chirurgie de la lésion par la 6-hydroxydopamine.

Lorsque la quantité de mort cellulaire provoquée par le neurotoxique a atteint son maximum, des rotations spontanées de 360 degrés peuvent être mesurées afin d'évaluer la réussite de la lésion par la six-hydroxydopamine. Dans cette évaluation comportementale, les souris présentant une déplétion induite par la six-hydroxydopamine supérieure à 95 % montrent significativement plus de rotations ipsiversives spontanées que les souris ayant subi une lésion partielle par la six-hydroxydopamine ou une opération témoin. En corrélant les niveaux de dopamine SAL avec le pourcentage de rotations ipsiversives spontanées chez chaque animal, on observe que les souris qui présentent 70 % ou plus de rotations ipsiversives après une lésion par la six-hydroxydopamine ont perdu plus de 95 % de la dopamine SAL.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment réaliser efficacement une lésion stéréotaxique et contrôlée par perfusion de l'hydroxydopamine six chez la souris. Cela entraînera une déplétion de la dopamine supérieure à 95 %. Vous devriez également comprendre comment effectuer une évaluation comportementale du parkinsonisme chez la souris.