Name: Assay saccharification haut débit pour les matériaux lignocellulosiques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 39 s
Description: Découvrez un test de saccharification haut débit pour évaluer la digestibilité de la biomasse lignocellulosique. Cette méthode automatisée permet de dépister rapidement les génotypes prometteurs pour la production de biocarburants.

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Les auteurs tiennent à remercier un Viksø-Nielsen (Novozymes) pour le don de les enzymes cellulolytiques. Ce travail a été financé par le 7e PC RENOUVELLEMENT et par les projets et le BBSRC BB/G016178 BB/G016194.

1. Préparation des échantillons Nous normalement travailler avec découle soit herbacées ou ligneuses. Dans le cas des matières herbacées nous cultivons les plantes à maturité, et après le développement des graines que nous recueillons tiges sèches fois la sénescence est terminée. Les tiges sont coupées en 4 segments mm et placés dans des flacons de 2 ml avec trois billes de broyage. Dans le cas de matières ligneuses, les échantillons sont broyés à la sciure grossière avec un fichier de bois de parcours et ensuite placé dans un broyeur à boulets pour un traitement ultérieur. Les échantillons sont placés dans un rack dans le meulage / formatage station (Figure 1). Cette station broie de façon séquentielle, les mélanges, et pèse chaque échantillon. Le nombre de répétitions nécessaires par échantillon est établie par des tests du matériel au sol dans une série d'expériences préliminaires, où la variabilité intrinsèque d'une certaine taille de particules est déterminée. Les flacons de 2 ml sont percés à la base et les matériaux sont dispensés par les vibrations de la fiole sur le bien sélectionné. Le bras vibrant est contrôlé par une rétroaction de l'équilibre permettant la distribution précise de la poudre. Le robot distribue 4 mg / puits dans une analyse standard et 4 répétitions sont nécessaires dans la plupart des cas. Cela permet à 20 échantillons de plantes / plateau pour être analysés. 2. Prétraitement Une fois les échantillons sont formatés, les plaques de 96 puits sont traitées par un système automatisé de manipulation des liquides (figure 2). Voici un prétraitement douce est effectuée sur les matières végétales en ajoutant 350 ul d'acide ou de solutions alcalines et chauffage de la plaque sur un bloc adapté. Pour éviter l'évaporation lors de l'analyse, la plaque de 96 puits sont scellés avec un mat en silicone. La température et l'heure du prétraitement peut être modifié en fonction des matériaux étudiés. La température maximale, cependant, est de 100 ° C. Une procédure alternative pour les tests plus sévères prétraitements est de prétraiter les matériaux hors ligne et d'éliminer les pretreatmet du processus. 3. L'hydrolyse <ol><li> Après les matériaux sont prétraités, le robot enlève automatiquement la solution de prétraitement, et les lavages, tous les puits, 5 fois avec 850 uL de tampon acétate 25 mM. Les rinçages sont effectués par addition de tampon à la solution de prétraitement, et ensuite retirer 50% du volume total après déduction des solides dans l'échantillon à régler. La hauteur de l'aspiration est fixé à la moitié de la masse liquide pour éviter l'aspiration des solides du fond du puits, il ya une perte négligeable de solides en utilisant cette approche. Après ces lavages, le pH dans le puits est de 4,5 et le matériel est prêt pour l'hydrolyse enzymatique. </li><li> Un mélange d'enzymes contenant une solution de cellulases et hémicellulases est ajouté par le robot. Dans chaque puits, 850 ul de mélange d'enzymes est dispensé et la plaque est déplacé dans un 50 ° C incubateur agitateur. L'hydrolyse standard est effectuée pendant 8 h, mais cette fois peut être adapté à l'objectif de l'expérience. Le chargement enzyme standard utilisé pour les graminées est de 7 FPU / g de matière. </li></ol> 4. La détection des sucres réducteurs Détermination des sucres réducteurs libérés après hydrolyse a été réalisée en utilisant une version modifiée du 3-méthyl-2-benzothiazolinone Hydrozone (MTBH) la méthode 3. MBTH a été sélectionnée comme la méthode la plus appropriée, car elle a été la plus facile à automatiser et les moins sensibles aux interférences provoquées par des composés tels que les protéines. Nous avons modifié cette méthode très sensible pour une utilisation sur la plate-forme robotique de sorte qu'il pouvait quantifier avec précision les sucres aux concentrations présentes dans les hydrolysats de biomasse, avec un volume final de 250 pi qui est approprié pour une optique standard 96 puits. Toutes les étapes ci-dessous sont effectuées automatiquement et de trois déterminations indépendantes de la réduction des sucres ont été réalisées pour chaque réaction de saccharification. <ol><li> 30 uL d'hydrolysat a été prise de la plaque de puits profonds et mélangés avec 45 ul de tampon de 25 mM d'acétate de sodium dans une jupe de PCR 96 puits. </li><li> 25 uL de NaOH 1N et 50 ul d'une solution contenant 0,43 mg / ml MBTH et 0,14 mg / ml TNT ont été ajoutés. </li><li> Après mélange, la plaque de PCR a été chauffé à 60 ° C pendant 20 min dans un thermocycleur ou d'un dispositif similaire qui offre exactement la même quantité de chaleur pour les 96 puits. </li><li> La réaction résultante a été transférée à une plaque optique. </li><li> Ajouter 100 pl de réactif oxydant (0,2% FeNH4 (SO4) 2, 0,2% d'acide sulfamique et de 0,1% HCl). Mélangez bien et laissez reposer pendant au moins 1 h. </li><li> Chaque plaque doit également contenir les réactions standard de 50 nmol, 100 et 150 nmol de glucose nmol. Les plaques optiques sont lues à 620 nm. </li></ol> 5. Les résultats représentatifs: Exemples de différents types d'analyses sont présentés dans la figure 3 et 4. Tous les résultats ont été obtenus en utilisant la plate-forme automatisée. La figure 3 représente la hausse des sucres réducteurs libérés par des incubations 8 h à partir du peuplier du sol avec des quantités croissantes d'enzymes cellulolytiques. La figure 4 présente les effets de l'acide et prétraitement alcalin sur des échantillons de peuplier. Le prétraitement NaOH est plus efficace que la dilution de H2SO4 prétraitement en vue de faciliter la libération des sucres pendant l'hydrolyse. La quantité de sucres mesurées après hydrolyse diminue lorsque le prétraitement est effectué en utilisant des concentrations de NaOH 1M supérieur. <img src="/files/ftp_upload/3240/3240fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Station robotique pour le broyage et la mise en forme 96 et de la biomasse <img src="/files/ftp_upload/3240/3240fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Station de traitement des liquides pour l'analyse de saccharification High Throughput <img src="/files/ftp_upload/3240/3240fig3.jpg" alt="Figure 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> Figure 3. Effet des charges enzymatiques différentes sur la libération de réduire les équivalents de sucre à partir d'échantillons de peuplier <img src="/files/ftp_upload/3240/3240fig4.jpg" alt="Figure 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 4"> Figure 4. Effet de prétraitements différents sur la saccharification des échantillons de peuplier. Sucres A. libéré après pretreament avec différents pourcentages de H2SO4 à 90 ° C pendant 30 minutes. Sucres B. libéré après prétraitements NaOH à la même température et le temps que le prétraitement d'acide .

<ol><li>Carpita, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+Biogenesis+of+the+Cell+Walls+of+Grasses%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Plant+Physiol+Plant+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Structure and Biogenesis of the Cell Walls of Grasses.</a> Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol. 47, 445-476 (1996).</li>
<li>Gomez, L. D., Steele-King, C. G., McQueen-Mason, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustainable+liquid+biofuels+from+biomass%3A+the+writing%27s+on+the+walls%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">Sustainable liquid biofuels from biomass: the writing's on the walls.</a> New Phytol. 178, 473-485 (2008).</li>
<li>Anthon, G. E., Barrett, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+reducing+sugars+with+3-methyl-2-benzothiazolinonehydrazone%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Determination of reducing sugars with 3-methyl-2-benzothiazolinonehydrazone.</a> Anal Biochem. 305, 287-289 (2002).</li>
<li>Gomez, L. D., Whitehead, C., Barakate, A., Halpin, C., McQueen-Mason, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+saccharification+assay+for+determination+of+digestibility+in+plant+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Biofuels%22%5BJournal%5D)">Automated saccharification assay for determination of digestibility in plant materials.</a> Biotechnol Biofuels. 3, 23-23 (2010).</li>
</ol>

Des variantes du protocole standard de saccharification peuvent être utilisées sur la même plateforme pour déterminer l'activité d'enzymes cellulolytiques (par exemple, en faisant varier les concentrations d'enzymes utilisées dans une plaque ainsi qu'en utilisant du papier comme substrat), comparer l'efficacité de plusieurs mélanges d'enzymes sur un matériau donné, établir un suivi cinétique de la saccharification, etc.
Un protocole standard de saccharification permettant de comparer le potentiel de saccharification de différents matériaux végétaux comprend une hydrolyse de huit heures (Figures 3 et 4). La plupart des matériaux végétaux analysés nécessitent quatre réplicats. Dans ces conditions, la plateforme peut traiter 80 échantillons par jour. Cette analyse est utilisée pour cribler de grandes populations d'orge, de maïs et de brachypode afin d'établir la variabilité du potentiel de saccharification et d'identifier les gènes impliqués dans sa détermination4.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du réactif </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th></tr><tr><td> Broyage et pesant robots </td><td> Labman automatisation </td><td></td></tr><tr><td> 2 ml micro tube avec des bouchons </td><td> Sarstedt Ltd </td><td> 72.694 </td></tr><tr><td> 5 mm billes en acier inoxydable </td><td> Qiagen Ltd </td><td> 69989 </td></tr><tr><td> 1.2ml ABgene carrés plaques de stockage bien </td><td> Fisher Scientific Ltd </td><td> TUL-050-050C </td></tr><tr><td> Whatman bouchon tapis pour 96 plaques carrées ainsi </td><td> Fisher Scientific Ltd </td><td> 7704-0104 </td></tr><tr><td> Hanling robots liquides </td><td> Tecan Group Ltd </td><td> Freedom EVO 200 </td></tr><tr><td> L&#39;acide sulfurique </td><td> Fisher Scientific Ltd </td><td> S/9231/PB17 </td></tr><tr><td> L&#39;hydroxyde de sodium </td><td> Fisher Scientific Ltd </td><td> BPE359-500 </td></tr><tr><td> L&#39;acétate de sodium </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S8750-500G </td></tr><tr><td> L&#39;acide acétique </td><td> Fisher Scientific Ltd </td><td> A/0420/PB17 </td></tr><tr><td> Novozyme 188 </td><td> Novozyme </td><td> DCN00214 </td></tr><tr><td> Celluclast 1.5L </td><td> Novozyme </td><td> CCN03122 </td></tr><tr><td> 96 puits Plaques PCR jupe </td><td> Sarstedt Ltd </td><td> 72.1980.202 </td></tr><tr><td> D-glucose </td><td> Fisher Scientific Ltd </td><td> G/0450/53 </td></tr><tr><td> 3-méthyl-2-benzothiazolinone hydrate de chlorhydrate hydrazone </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 129 739-25G </td></tr><tr><td> DL-dithiothréitol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D9163-1G </td></tr><tr><td> Corning microplaque de 96 puits à fond plat </td><td> Fisher Scientific Ltd </td><td> TKT-521-050H </td></tr><tr><td> De fer de sulfate d&#39;ammonium dodécahydraté (III) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F1668-250G </td></tr><tr><td> L&#39;acide sulfamique </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 242772-500G </td></tr><tr><td> L&#39;acide chlorhydrique </td><td> Fisher Scientific Ltd </td><td> 12462-0026 </td></tr></tbody></table>

assay saccharification haut débit pour les matériaux lignocellulosiques

High-throughput Saccharification Assay for Lignocellulosic Materials

Les polysaccharides qui forment la biomasse végétale lignocellulosique peut être décomposé pour produire une gamme de sucres qui pourra ensuite être utilisée pour établir une bioraffinerie. Ces matières premières constituerait une nouvelle plateforme industrielle, qui est à la fois durable et neutre en carbone, pour remplacer l&#39;actuelle dépendance des combustibles fossiles. La réticence à la déconstruction observé dans les matières lignocellulosiques est produit par plusieurs propriétés intrinsèques des parois des cellules végétales. Cellulose cristalline est intégré dans les polysaccharides tels que la matrice xylanes et arabinoxylanes, et toute la structure est enveloppée par le polymère phénolique lignine, qui est aussi difficile à digérer 1. Afin d&#39;améliorer la digestibilité des matières végétales, nous devons découvrir les principaux goulots d&#39;étranglement pour la saccharification des parois cellulaires et mutant d&#39;écran aussi, et les populations nicheuses d&#39;évaluer la variabilité de la saccharification 2. Ces tâches nécessitent une approche à haut débit et ici, nous présentons une plate-forme d&#39;analyse qui peut effectuer une analyse saccharification dans un format plaque de 96 puits. Cette plateforme a été développée pour permettre le dépistage de la digestibilité de lignocellulose uniquement d&#39;importantes populations d&#39;espèces végétales variées. Nous avons réduit les volumes de réaction pour le prétraitement doux, hydrolyse enzymatique partielle de sucre et de détermination, pour permettre à un grand nombre d&#39;être évalués rapidement dans un système automatisé. Cette plate-forme automatisée fonctionne avec des quantités milligramme de biomasse, effectuant broyage dans des conditions contrôlées pour réduire les matières végétales pour une taille de particules standard d&#39;une manière reproductible. Une fois les échantillons sont broyés, le robot automatisé formatage dispense montants spécifiés et enregistré des matériaux dans les puits correspondants de plaque de 96 puits profonds (figure 1). Normalement, nous dispenser de la même matière en 4 puits pour avoir 4 répétitions pour l&#39;analyse. Une fois les plaques sont remplis avec du matériel végétal dans les aménagements souhaités, ils sont déplacés manuellement à une station de traitement des liquides (figure 2). Dans cette station, les échantillons sont soumis à un prétraitement doux avec de l&#39;acide dilué ou alcaline et incubés à des températures allant jusqu&#39;à 90 ° C. La solution de prétraitement est ensuite retirée et les échantillons sont rincés avec du tampon pour les retourner à un pH adapté à l&#39;hydrolyse. Les échantillons sont ensuite incubés avec un mélange d&#39;enzymes pour une durée de temps variable à 50 ° C. Une aliquote est tirée de l&#39;hydrolysat et les sucres réducteurs sont automatiquement déterminés par la méthode colorimétrique MBTH.

Une méthode simple et rapide pour déterminer le potentiel de saccharification d&#39;un grand nombre d&#39;échantillons de biomasse végétale est décrite. La plate-forme automatisée pour cette analyse implique la préparation de la biomasse végétale pour l&#39;analyse des plaques à 96 puits et la performance subséquente de prétraitement, l&#39;hydrolyse et la quantification des sucres libérés.

Assay saccharification haut débit pour les matériaux lignocellulosiques

Les polysaccharides qui constituent la biomasse lignocellulosique végétale peuvent être décomposés pour produire une gamme de sucres qui peuvent ensuite être utilisés pour établir...

Bonjour, je suis Kara Ted, je suis Leo. Allez, c'est moi. Et je suis Simon McQueen Mason.La digestibilité de la biomasse végétale est un sujet d'un grand intérêt à l'heure actuelle. En effet, une grande quantité de sucres est piégée dans les polysaccharides des parois cellulaires végétales qui constituent cette biomasse, et si nous parvenons à extraire ces sucres sous une forme utilisable, nous pourrons les fermenter afin de produire toutes sortes de produits, tels que des carburants et des produits chimiques. Malheureusement, ces matériaux sont extrêmement difficiles à digérer, et il est urgent de mieux comprendre les facteurs qui contrôlent cette digestibilité.Afin de pouvoir utiliser la matière végétale pour la production de groupes renouvelables, nous devons être en mesure de mesurer le potentiel de fication de ces plantes. Ici, à l'Université de York, nous analysons de grandes populations de matériel végétal afin de déterminer leur potentiel de fication. La fication est le processus de dégradation des glucides complexes en leurs composants monosaccharidiques, permettant ainsi la production de produits chimiques de valeur par divers procédés industriels.Pour mesurer le potentiel de saccharification, nous reproduisons des procédés industriels à une échelle microscopique où nous soumettons la biomasse à un prétraitement et à une hydrolyse enzymatique afin de déterminer les sucres libérés. Cela permet d'identifier des variétés intéressantes parmi les génotypes. Le système à haut débit fonctionne selon un format de plaque IG à six puits.Des conditions douces d'hydrolyse sont utilisées pour révéler des différences subtiles entre génotypes, et la méthode est suffisamment souple pour permettre l'utilisation de divers matériaux de substrat ainsi que l'évaluation d'enzymes différentes. La méthode que nous utilisons implique la préparation du matériel végétal sous forme de poudre, qui est ensuite prétraitée avec un acide ou une base dilué à 90 degrés pendant 20 minutes. Ensuite, une digestion enzymatique est réalisée à l'aide d'un mélange commercial de cellulase à 50 degrés pendant huit heures.Enfin, une méthode MBTH est utilisée pour déterminer la libération de sucres réducteurs. Le matériel végétal est récolté sous forme de tiges sèches, découpées en segments de quatre millimètres. Ceux-ci sont placés dans des vials de deux millilitres contenant trois billes métalliques de cinq millimètres.Les vials sont étiquetés individuellement avec des codes-barres, qui sont scannés afin d'assurer la traçabilité des échantillons. Les échantillons sont chargés dans les robots de broyage et de formatage. Les échantillons sont broyés et mélangés automatiquement afin de permettre la distribution de la biomasse dans une plaque de 96 puits.Les flacons sont perforés, puis le flacon est repositionné dans le bras robotisé de manière à se trouver à l'intérieur d'un entonnoir qui vibre pour distribuer la poudre. La vibration de l'entonnoir est régulée par une balance afin d'obtenir la quantité cible en masse par puits distribuée. La biomasse est distribuée dans 10 colonnes des plaques, deux colonnes étant réservées aux étalons.En effectuant quatre répétitions par échantillon, nous chargeons 20 échantillons par plaque. L'hydrolysat de cette plaque sera réparti en trois exemplaires dans des plaques PCR, produisant ainsi trois plaques optiques. De cette manière, nous obtenons trois déterminations de sucres réducteurs par puits de biomasse.Une fois préparées, les plaques sont scellées avec un tapis en silicone afin d'éviter l'évaporation. Lorsqu'elles sont prêtes, elles sont transférées vers le robot de manipulation des liquides. Sur ce robot, le prétraitement, l'hydrolyse enzymatique et la détermination des sucres libérés sont effectués automatiquement.La table de deux mètres comporte des compartiments pour les différents réactifs nécessaires, ainsi qu'un espace de rangement pour la vaisselle plastique. Des incubateurs sont prévus pour le prétraitement et l'hydrolyse, ainsi que des thermocycleurs pour la détermination des sucres. Le prétraitement est effectué dans la plaque à puits profonds.En ajoutant des solutions acides ou alcalines diluées au poudre de biomasse. Les plaques sont transférées sur le bloc chauffant et incubées à 90 degrés pendant 20 minutes. Une fois cette incubation terminée, le prétraitement est éliminé par cinq rinçages avec 500 microlitres de tampon acétate.Une fois le prétraitement rincé, un cocktail d'enzymes est ajouté. Il s'agit d'un mélange standard contenant de la cellulase et du Novozyme 188 dans un rapport de quatre pour un, à une concentration de sept UFP par puits.Les plaques sont incubées pendant huit heures à 50 degrés sous agitation. 75 microlitres de l'hydrolysat obtenu sont transférés dans une plaque PCR. Dans les colonnes 11 et 12 des plaques PCR, on ajoute les étalons de glucose.Ensuite, 25 microlitres d'une solution d'hydroxyde de sodium à un molaire sont ajoutés à tous les puits. Enfin, 50 microlitres de réactif MBTH sont pipetés dans la plaque PCR. La plaque à puits profonds est stockée après l'achèvement du transfert de l'hydrolysat vers la troisième plaque PCR.Alors que les plaques de PCR sont transférées dans les thermocycleurs pour une incubation à 60 degrés pendant 15 minutes. La dernière étape du processus consiste à transférer le mélange réactionnel dans des plaques optiques afin de développer la couleur. Après l'incubation, les plaques de PCR sont retirées du thermocycleur.Cent microlitres de réactif oxydant sont ajoutés au mélange réactionnel transféré. Pour faciliter le développement de la couleur, le processus de manipulation liquide est effectué quatre fois en 24 heures, la rinçage de prétraitement et l'ajout d'enzyme prenant environ deux heures. L'hydrolyse enzymatique dure huit heures, et la détermination du sucre prend deux heures supplémentaires.Pendant que la première plaque est incubée pendant huit heures, la plaque suivante commence le processus. Grâce à cette répartition des ressources robotisées, un débit de trois cycles permettant d'analyser 80 échantillons par jour est atteint afin de déterminer la quantité de sucres réducteurs libérés. Les plaques sont lues à 620 nanomètres.Les résultats obtenus sont analysés afin de quantifier les sucres libérés en nanomoles par milligramme par heure de réaction. Merci donc d'avoir regardé, et j'espère que cela inspirera vos recherches dans le domaine des biocarburants.

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