Assay saccharification haut débit pour les matériaux lignocellulosiques

Bonjour, je m’appelle Kara Ted, je m’appelle Leo. Allez-y. Et je suis Simon McQueen Mason.

La digestibilité de la biomasse végétale est un sujet de grand intérêt à l’heure actuelle. C’est parce qu’il y a beaucoup de sucres liés dans les polysaccharides des parois cellulaires végétales qui composent cette biomasse, et si nous pouvons extraire ces sucres sous une forme utilisable, nous pouvons les faire fermenter pour produire toutes sortes de produits tels que des carburants et des produits chimiques. Malheureusement, ces matériaux sont extrêmement difficiles à digérer et il est urgent de mieux comprendre ce qui contrôle cette digestibilité.

Donc, pour pouvoir utiliser du matériel végétal pour la production de groupe renouvellement, nous devons être en mesure de mesurer le potentiel d’ification dans ces plantes. C’est pourquoi, ici, à l’Université de York, nous examinons de grandes populations de matériel végétal pour déterminer leur potentiel de fidélisation. La fication est le processus de décomposition des glucides complexes en leurs composants monosaccharidiques pour produire des produits chimiques précieux via différents processus industriels.

Pour mesurer le potentiel de fication, nous reproduisons des procédés industriels à l’échelle microscopique où nous soumettons la biomasse à un prétraitement et à une hydrolyse enzymatique pour déterminer les sucres libérés. Cela permet d’identifier des variétés intéressantes dans les génotypes. Le système à haut débit fonctionne dans un format de plaque IG à six puits.

Des conditions douces d’hydrolyse sont utilisées pour exposer les différences subtiles entre les génotypes, et il est également suffisamment flexible pour supporter différents matériaux de substrat ainsi que pour évaluer différentes enzymes. La méthode que nous utilisons consiste à formater la matière végétale sous forme de poudre, qui est ensuite prétraitée avec un acide dilué ou alcalin à 90 degrés pendant 20 minutes. Ensuite, une digestion enzymatique est effectuée à l’aide d’un mélange commercial de cellulase à 50 degrés pendant huit heures.

Enfin, une méthode MBTH est utilisée pour déterminer la libération de sucres réducteurs. La matière végétale est récoltée sous forme de tiges sèches, qui sont coupées en segments de quatre millimètres. Ceux-ci sont placés dans des flacons de deux millilitres avec trois billes métalliques de cinq millimètres.

Les flacons sont étiquetés individuellement avec des codes-barres, qui sont scannés pour assurer la traçabilité des échantillons. Les échantillons sont chargés dans les robots de broyage et de formatage des robots. Les échantillons sont automatiquement broyés et mélangés pour permettre la distribution de la biomasse dans une plaque de 96 puits.

Les flacons sont percés, puis le flacon est repositionné dans le bras robotique de manière à ce qu’il se trouve dans un entonnoir qui vibre pour distribuer la poudre. La vibration de l’entonnoir est régulée par une balance pour atteindre la quantité cible de masse par puits distribué. La biomasse est distribuée dans 10 colonnes des plaques, laissant deux colonnes pour les étalons.

En faisant quatre répétitions par échantillon, nous chargeons 20 échantillons par plaque. L’hydrolysat de cette plaque sera triplé en plaques PCR, ce qui donnera trois plaques optiques. De cette façon, nous avons trois déterminations de sucres réducteurs par puits de biomasse.

Une fois formatées, les plaques sont scellées avec un tapis de silicone pour éviter l’évaporation. Lorsqu’ils sont prêts, ils sont déplacés vers le robot de manipulation des liquides. Dans la manipulation des liquides, le prétraitement par robot, l’hydrolyse enzymatique et la détermination des sucres libérés sont effectués automatiquement.

La table de deux mètres dispose de récipients pour les différents réactifs nécessaires, ainsi que d’un espace de stockage pour la vaisselle en plastique. Il existe des incubateurs pour le prétraitement et l’hydrolyse, ainsi que des thermocycleurs pour la détermination du sucre. Le prétraitement se fait dans la plaque à puits profond.

En ajoutant des solutions acides ou alcalines diluées à la poudre de biomasse. Les plaques sont transférées dans le bloc chauffant et incubées à 90 degrés pendant 20 minutes. Lorsque cette incubation est terminée, le prétraitement est éliminé par rinçage cinq fois avec un tampon d’acétate de 500 microlitres.

Une fois le prétraitement rincé, un cocktail d’enzymes est ajouté. C’est un mélange standard. Il contient de la cellulose, un novozyme 1, 8, 8 dans un rapport de quatre pour un à une concentration de sept FPU par puits.

Les plaques sont incubées pendant huit heures à 50 degrés tout en secouant. 75 microlitres de l’hydrolysat obtenu sont transférés sur une plaque PCR. Dans les colonnes 11 et 12 des plaques PCR, les étalons de glucose sont ajoutés.

Ensuite, 25 microlitres d’une molaire d’hydroxyde de sodium sont ajoutés à tous les puits. Enfin, 50 microlitres de réactif MBTH sont pipetés dans la plaque PCR. La plaque de puits profond est stockée après l’achèvement du transfert de l’hydrolysat sur la troisième plaque PCR.

Alors que les plaques PCR sont déplacées vers les thermocycleurs pour une incubation à 60 degrés pendant 15 minutes. La dernière étape du processus est le transfert du mélange réactionnel sur des plaques optiques pour le développement de la couleur. Après l’incubation, les plaques PCR sont retirées du thermocycleur.

Une centaine de microlitres de réactif oxydant sont ajoutés au mélange réactionnel transféré. Pour faciliter le développement de la couleur, le processus de manipulation des liquides est exécuté quatre fois en 24 heures, où le rinçage de prétraitement, l’ajout d’enzyme prend environ deux heures. L’hydrolyse de l’enzyme prend huit heures et la détermination du sucre prend encore deux heures.

Alors que la première assiette est en incubation pendant huit heures, l’assiette suivante commence le processus. Grâce à cette allocation des ressources robotiques, un trois put de 80 échantillons par jour est réalisé pour déterminer la quantité de sucres réducteurs libérés. Les plaques optiques sont évaluées à 620 nanomètres.

Les résultats obtenus sont analysés pour quantifier les sucres de libération en nanomoles par milligramme par heure de réaction. Alors merci d’avoir regardé, et j’espère que cela inspirera vos recherches sur les biocarburants.